Μελέτη των μηχανισμών του stress σε πρωτογενείς καλλιέργειες και Hsp70 - διαγονιδιακών ποντικών: μοντέλο δοξορουβικίνης / καρδιακής ανεπάρκειας

Abstract

HSP70 is one of the most popular, well studied molecular chaperones and the most important heat shock protein, whose expression is induced in cells after exposure to various physical or chemical environmental stimuli. Also, it participates directly or indirectly in several key cellular pathways. The aim of this study was to investigate the potential protective effect of the Hsp70 protein in the cardiac dysfunction induced by doxorubicin (DOX), an important anti-cancer drug that is a potential heart failure inducer, as well as the mechanisms of its action, in wild-type mice (F1/F1) and Hsp70-transgenic mice (Tg/Tg) overexpressing human HSP70. The in vivo cardiac function assessment by transthoracic echocardiography and the analysis of the cardiac markers following chronic DOX administration, showed that the reduction in left ventricular systolic function observed after DOX administration was lower in Tg/Tg mice and that overexpression of Hsp70 contributed to the protection of the myocardium of the experimental animals against doxorubicin. In myocardial protein extracts from identical mice with DOX-induced heart failure, the induction of the apoptotic process and the activation of the caspase cascade were observed. Our results indicated that in Tg/Tg transgenic mice the overexpression of Hsp70 provides protection from myocardial damage via an Hsp70-block in p53 activation, thus reducing the subsequent apoptotic mechanism.Next, at cellular level, the toxic effects of doxorubicin and the protective role of Hsp70 against doxorubicin were studied. In primary cell cultures (F1/F1 and Tg/Tg cells), isolated from embryos of these mice and exposed to various concentrations and incubation times with doxorubicin, the dose- and time-dependent toxicity of the drug to the cells was demonstrated with all experimental procedures that were performed. The biochemical characterization of the doxorubicin-induced apoptotic pathway in primary embryonic cell lines revealed that p53 was activated, which then promotes the mitochondrial apoptotic signals and the caspase cascade. Specifically, p53 activates Bax, caspase-9 and caspase-3, while the activation of PARP-1 reveals the DOX-induced DNA damage. This apoptotic pathway appeared to be inhibited by the high expression of human Hsp70 in the primary embryonic Tg/Tg cells. Consequently, it can be concluded that Hsp70 may prevent the promotion of apoptosis induced by doxorubicin, acting at a site upstream of p53 activation.The protective effect of Hsp70 was demonstrated, also, with determination of the activity of the antioxidant enzymes, SOD and GPx. Doxorubicin administration appeared to result in a dose-and time-dependent decrease in activity of these enzymes in primary embryonic cells. The increased activity of these antioxidant enzymes in Tg/Tg cells compared to that of the control F1/F1 cells was obvious, suggesting that the presence of Hsp70 in cells renders them more resistant to doxorubicin-induced oxidative stress.Finally, at clinical level, the expression levels of the inducible Hsp70 were quantified in serum from patients with heart failure. Our results showed that in heart failure the concentration of Hsp70 appeared to be increased in blood sera of patients compared to that of healthy individuals. The enhanced expression of Hsp70 in serum of patients with heart failure seems to be associated with various features, such as gender, age and the type of heart failure, but not with its etiology.Overall, in the present study was examined the potential association between the Hsp70 protein and the heart failure and new evidence came to light concerning the possible mechanism of its action.

Η HSP70, η πιο σημαντική πρωτεΐνη θερμικού σοκ, αποτελεί έναν από τους δημοφιλέστερους μοριακούς συνοδούς και επάγεται στα κύτταρα μετά από έκθεσή τους σε διάφορα φυσικά ή χημικά περιβαλλοντικά ερεθίσματα, ενώ εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλά βασικά κυτταρικά μονοπάτια. Σκοπός της παρούσας εργασίας, αρχικά, ήταν η διερεύνηση της προστατευτικής επίδρασης της πρωτεΐνης Hsp70 στην καρδιακή δυσλειτουργία, που επάγεται από τη δοξορουβικίνη (DOX), ένα σημαντικό αντικαρκινικό φάρμακο που αποτελεί ένα δυνητικό παράγοντα πρόκλησης καρδιακής ανεπάρκειας, καθώς και οι μηχανισμοί δράσης της, σε αγρίου τύπου ποντίκια (F1/F1) και διαγονιδιακά ποντίκια (Tg/Tg), που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη Hsp70. Η εκτίμηση της καρδιακής λειτουργίας in vivo με διαθωρακική ηχοκαρδιογραφία και η ανάλυση των καρδιακών δεικτών μετά από χρόνια χορήγηση δοξορουβικίνης, έδειξαν πως η μείωση της συστολικής λειτουργίας της αριστερής κοιλίας εξασθενεί στα Tg/Tg ποντίκια και ότι η υπερέκφραση της Hsp70 συνεισέφερε στην προστασία του μυοκαρδίου των πειραματοζώων ενάντια στη δοξορουβικίνη. Σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από το μυοκάρδιο των ίδιων ποντικιών με επαγόμενη από δοξορουβικίνη καρδιακή ανεπάρκεια, παρατηρήθηκε η επαγωγή της αποπτωτικής διαδικασίας, μέσω της ενεργοποίησης του καταρράκτη των κασπασών. Η υπερέκφραση της Hsp70 στα διαγονιδιακά Tg/Tg ποντίκια παρείχε προστασία ενάντια στη βλάβη του μυοκαρδίου μέσω παρεμπόδισης της ενεργοποίησης της p53 από την Hsp70, αναστέλλοντας, επομένως, τον επακόλουθο αποπτωτικό μηχανισμό.Σε κυτταρικό επίπεδο, μελετήθηκαν, επίσης, η τοξικότητα της δοξορουβικίνης και ο προστατευτικός ρόλος της Hsp70 ενάντια στο φάρμακο. Σε πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες (F1/F1 και Tg/Tg), που απομονώθηκαν από τα ίδια πειραματόζωα και εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις και χρόνους επώασης με δοξορουβικίνη, αποδείχθηκε η δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη τοξική επίδραση του φαρμάκου στα κύτταρα σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες, που διενεργήθηκαν. Η βιοχημική μελέτη του επαγόμενου από δοξορουβικίνη αποπτωτικού μονοπατιού στις πρωτογενείς εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές, αποκάλυψε ότι ενεργοποιείται η p53, η οποία, στη συνέχεια, προωθεί το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι και τον καταρράκτη των κασπασών. Πιο συγκεκριμένα, η p53 φαίνεται να ενεργοποιεί τις Bax, κασπάση-9 και κασπάση-3, ενώ η ενεργοποίηση της PARP-1 αποκαλύπτει την επαγόμενη από DOX βλάβη του DNA. Το αποπτωτικό αυτό μονοπάτι φαίνεται να αναστέλλεται από την αυξημένη έκφραση της Hsp70 στα Tg/Tg κύτταρα. Συνεπώς, συμπεραίνεται ότι η Hsp70 μπορεί να αποτρέπει την προώθηση της απόπτωσης, που προκαλείται από τη δοξορουβικίνη, δρώντας σε ένα σημείο ανοδικά της ενεργοποίησης της p53. Η προστατευτική επίδραση της πρωτεΐνης Hsp70 αποδείχθηκε και με την εκτίμηση της δραστηριότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων, SOD και GPx. Η δοξορουβικίνη προκάλεσε δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα της δραστηριότητας των ενζύμων αυτών στα πρωτογενή εμβρυικά κύτταρα. Η δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων ήταν εμφανώς αυξημένη στα Tg/Tg σε σύγκριση με τα F1/F1 κύτταρα, προτείνοντας ότι η παρουσία της Hsp70 προσδίδει στα κύτταρα μεγαλύτερη ανθεκτικότητα ενάντια στo προκαλούμενο από δοξορουβικίνη οξειδωτικό στρες.Τέλος, σε κλινικό επίπεδο, προσδιορίστηκαν ποσοτικά τα επίπεδα έκφρασης της επαγόμενης Hsp70 σε ορούς ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια. Από τα αποτελέσματα μας προέκυψε ότι στην καρδιακή ανεπάρκεια φαίνεται να αυξάνεται η συγκέντρωση της Hsp70 στους ορούς αίματος των ασθενών σε σχέση με αυτή των υγιών ατόμων. Η αυξημένη έκφραση της Hsp70 στους ορούς ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια φαίνεται να συσχετίζεται με διάφορες παραμέτρους, όπως το φύλο, την ηλικία και τον τύπο της καρδιακής ανεπάρκειας, αλλά όχι και με την αιτία πρόκλησης της ασθένειας.Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η πιθανή σύνδεση της πρωτεΐνης Hsp70 με την καρδιακή ανεπάρκεια, ενώ ταυτόχρονα ήλθαν στο φως νέα στοιχεία σχετικά με τον πιθανό μηχανισμό δράσης της.