Επιδράσεις του υδρόθειου στο καρδιαγγειακό σύστημα και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις

Abstract

Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality globally. Coronary artery disease (CAD) is the most common form of CVDs in which atherosclerosis plays a key role in the dysfunction of large- and medium-sized arteries. This inflammatory process is mediated by pro-atherosclerotic factors, such as high blood pressure, inflammatory factors, lipid accumulation, and hyperhomocysteinemia, and causes endothelial dysfunction. Inflammation and monocyte cell adhesion to endothelium are two key point processes in the early stages of atherogenesis. Adhesion is a process mediated via expression of adhesion molecules on endothelium surface (especially ICAM1 and VCAM1) and inflammatory chemokines such as monocyte chemmoattractant protein-1 (MCP-1). This process is induced by tumor necrosis factor-α (TNFα) and other interleukins. Hydrogen sulfide (H2S) is a colorless gas with a characteristic rotten-egg odor that has traditionally been considered to be a toxic pollutant. Recently it has been identified as the third gaseous mediator, along with CO and NO, with pleiotropic effects, including anti-oxidative, anti-inflammatory and cardioprotective properties. H2S interferes with the pro-atherogenic inflammatory processes occurring in the early stages of atherosclerosis by affecting signaling pathways that TNFα is involved. Also recent reports demonstrated that H2S ameliorates cellular oxidative stress and also acts as an endogenous scavenger for reactive oxygen species (ROS). The NADPH oxidase (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase) is a membrane-bound enzyme complex, responsible for ROS production in cells.H2S can be produced in eukaryotic cells through the transsulfuration pathway from homocysteine and cysteine. This process is mediated by three enzymes, namely, cystathionine b-synthase (CBS), cystathionine c-lyase (CSE), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (MST) in combination with cysteine aminotransferase (CAT). H2S production in the endothelium is attributed to the enzymatic action of CSE with cysteine as a substrate, as there is no evidence for the involvement of CBS in endothelial production of H2S. In pathophysiological conditions, such as atherosclerosis, altered H2S bioavailability may be caused by reduced expression of the H2S-generating enzyme gene, named cystathionie γ-lyase (CTH) in the endothelium. CTH expression may have genetic or epigenetic background, thus we sought to investigate whether CTH 1364 G>T polymorphism is associated with CAD in coronary artery bypass grafting (GABG) patients compared with non-atherosclerotic individuals.The aim of this study was to investigate the possible anti-atherosclerotic / anti-inflammatory role of exogenous H2S by analyzing the molecular mechanisms that are involved in these processes as well as to shed light on genetic and epigenetic mechanisms of H2S production in CABG patients and control subjects. CABG surgery involves patients with well-documented and severe CAD. Hence, the study of CAD in a context of the CABG surgery serves as an advantageous model for disease phenotype ascertainment and genetic association studies.EAhy926 endothelial cells were used for the in vitro atherosclerotic model and grown to confluence in 12-well plates. Cells were serum-starved and then incubated with several concentrations of H2S donors GYY4137 and thioglycine for 60min and then with TNFα (10ng/ml) for 120min. Medium was then removed, THP-1 monocytes were seeded on TNFα activated EAhy926 monolayers and co-incubated for 60 min at 37oC. Adhesion was counted on randomly selected magnification microscopic fields/well. Total RNA was extracted from EAhy926 cells (treated with thioglycine and GYY4137 with several concentrations for 1h and alone or in parallel with TNFα (10ng/ml) for 120 min) and reverse-transcribed into cDNA. qPCR experiments for MCP-1 and ICAM1 mRNA levels were performed and expression levels were evaluated for each gene by comparing samples treated with H2S donors with negative control treatment. EAhy926 medium was used to measure MCP-1 secreted protein levels. Protein expression of NADPH oxidase subunits was assessed by Western blot analysis of whole cell lysates. The levels of subunit protein expression were quantified by measuring band intensities and expressed as a ratio to β-actin expression.The clinical study included 334 subjects of Greek origin (178 cases with CAD and who underwent CABG, and 156 controls). Whole blood was taken from these subjects, DNA was isolated and we genotyped the CTH 1364 G>T polymorphism by a polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism (PCR–RFLP) analysis. Also, we studied the CTH promoter methylation profile by using a SYBR Green-based quantitative methylation-specific polymerase chain reaction (qMSP-PCR).Control-confluent EAhy926 showed minimal binding to THP-1 cells, while the adhesion of THP-1 was significantly increased to TNFα stimulated EAhy926. EAhy926 pre-treatment with thioglycine for 60min caused a dose dependent inhibitory effect on THP-1 adhesion that reached 48.2 ± 3.2% in 500μM thioglycine dose (P = 0.001). Pre-treatment with 300μM and 500μM GYY4137 for 60 min caused also dose dependent inhibition of THP-1 adhesion up to 68.3% ± 2.5 (P=0.001). MCP-1 mRNA levels were significantly reduced in EAhy926 cells co-incubated with TNFα and 500μM GYY4137 (P<0.001) or 500μM thioglycine (P<0.001), compared to TNFα alone. ICAM1 mRNA levels were significantly reduced in EAhy926 cells co-incubated with TNFα and 300μM (P=0.041) and 500μM thioglycine (P<0.001) compared to TNFα alone. Respectively GYY4137 showed a trend of reduction in ICAM1 mRNA levels in 500μM dose but did not reach statistical significance. Secreted MCP-1 protein levels showed a dose-dependent reduction for both GYY4137 and thioglycine but with no statistical significance. Regarding the expression of NADPH subunits, levels of cytoplasmic p47phox and its phosphorylated activated subunit, phosphop47phox, were increased after TNFα stimulation (P = 0.02 and P = 0.035 respectively), while expression of the gp91phox was not affected. Incubation of EAHy926 endothelial cells with 500 μM thioglycine prior to stimulation with TNFα caused a decrease in the expression of p47phox (P = 0.014) and phosphop47phox (P = 0.028) subunits, compared to EAHy926 cells incubated only with TNFα. Regarding GYY4137 donor, incubation of endothelial cells EAHy926 with 500 μM GYY4137 prior to stimulation with TNFα caused a significant decrease in the expression of p47phox (P = 0.005) and phosphop47phox (P = 0.043) subunits compared to EAHy926 cells incubated only with TNFα.No significant difference in the frequency of CTH 1364 G>T genotypes (P=0.281) and alleles (P = 0.265) was found between CABG patients and control subjects. Notably, we found increased methylation in CTH promoter in cases (19.1%) compared to controls (10.3%) (P = 0.024). Gene-by-sex analysis sustained the significant association in men (P = 0.032) but not in women (P = 0.884). By using multivariate analyses after controlling for potential confounders such as smoking, age, and gender, we found that increased CTH gene promoter methylation was associated with CAD in the total sample (odds ratio [OR] = 2.163, 95% confidence interval [CI] 1.038–4.506, P =0.039) and in men (OR= 2.418, 95% CI 1.048–5.581, P = 0.039) but not in women (OR= 0.542, 95% CI 0.094–3.140, P = 0.495). According to our results, H2S interferes with pro-inflammatory and pro-atherogenic processes by inhibiting monocyte cell adhesion and attenuating expression of MCP-1 and ICAM1 in inflamed endothelial cells. Both GYY4137 and thioglycine can exert a potential protective role in atherosclerotic pathogenesis by inhibiting monocyte cell adhesion to endothelial cells. Treatment with H2S donors might, thus, be a new approach against this pathological process. Furthermore, H2S donors may have the ability to attenuate and prevent the known deleterious effects of elevated ROS through modification of the NADPH oxidase-dependent redox signaling pathway. Moreover, we found that CTH 1364 G>T gene polymorphism is not associated with CAD in a Caucasian Greek population. We also report here new observations from a case-control epigenetic association study on promoter methylation of the CTH gene and its association with CAD and we found that hypermethylation of CTH promoter is an independent predisposing factor for CAD appearance among men. To the best of our knowledge, this is the first clinical study to show the DNA methylation status of the CTH promoter in relation to this clinical phenotype. Overall, the findings reported in this thesis further expand our knowledge on the roles and mechanisms of H2S regarding cardiovascular function and pathology. Delineating the molecular, genetic and epigenetic mechanisms that involve H2S may contribute to the development of novel therapeutic approaches to reduce cardiovascular risk in the future.

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως. Η στεφανιαία νόσος (CAD) είναι η πιο συνηθισμένη μεταξύ των καρδιαγγειακών νοσημάτων και προκύπτει από την αθηροσκλήρωση του αρτηριακού τοιχώματος των στεφανιαίων αρτηριών. Αυτή η διαδικασία προκαλείται από παράγοντες που προάγουν την αθηροσκλήρωση, όπως η υψηλή αρτηριακή πίεση, οι φλεγμονώδεις παράγοντες, η συσσώρευση λιπιδίων και η υπερομοκυστεϊναιμία και προκαλεί ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. Η φλεγμονή και η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο είναι δύο κύριες διαδικασίες στα αρχικά στάδια της αθηρογένεσης. Η προσκόλληση είναι μια διαδικασία που διαμεσολαβείται από μόρια προσκόλλησης στην επιφάνεια του ενδοθηλίου (ειδικά τα μόρια ICAM1 και VCAM1) και φλεγμονώδεις χημειοκίνες όπως η χημειοελκτική πρωτεΐνη-1 των μονοκυττάρων (MCP-1). Η διαδικασία της φλεγμονής επάγεται τόσο από τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (TNFα) όσο και από τις ιντερλευκίνες. Το υδρόθειο (H2S) είναι ένα άχρωμο αέριο με χαρακτηριστική οσμή χαλασμένου αυγού που παραδοσιακά θεωρούνταν τοξικός ρύπος. Πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ο τρίτος αέριος διαβιβαστής, μαζί με το μονοξείδιο του άνθρακα (CO) και το μονοξείδιο του αζώτου (NO), με πλειοτροπικές δράσεις που περιλαμβάνουν αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και καρδιοπροστατευτικές ιδιότητες. Το H2S εμπλέκεται στις φλεγμονώδεις διεργασίες που προάγουν την αθηρογένεση, οι οποίες εμφανίζονται στα πρώιμα στάδια της αθηροσκλήρωσης, επηρεάζοντας τις οδούς σηματοδότησης που εμπλέκουν τον TNFα. Επίσης, πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα έδειξαν ότι το H2S δρα ευεργετικά μειώνοντας το οξειδωτικό στρες των κυττάρων και δρα επίσης ως ενδογενής εξολοθρευτής των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Η οξειδάση NADPH (Νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδική φωσφορική οξειδάση) είναι ένα δεσμευμένο στην κυτταρική μεμβράνη ενζυμικό σύμπλοκο, υπεύθυνο για την παραγωγή των ROS στα κύτταρα.Το H2S μπορεί να παραχθεί σε ευκαρυωτικά κύτταρα από ομοκυστεΐνη και κυστεΐνη, μέσω των ενζύμων μεταβολισμού της L-κυστεΐνης. Η διαδικασία αυτή διαμεσολαβείται από τρία ένζυμα και πιο συγκεκριμένα τη β-συνθάση της κυσταθειονίνης (CBS), τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) και την 3-μερκαπτοπυροσταφυλική σουλφοτρανσφεράση (MST) σε συνδυασμό με την αμινοτρανσφεράση της κυστεΐνης (CAT). Η παραγωγή του H2S στο ενδοθήλιο αποδίδεται στην ενζυματική δράση του CSE χρησιμοποιώντας την κυστεΐνη ως υπόστρωμα, ενώ τα υπάρχοντα στοιχεία δείχνουν απουσία εμπλοκής του ενζύμου CBS στην ενδοθηλιακή παραγωγή του H2S. Σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις όπως η αθηροσκλήρωση, η διαταραγμένη βιοδιαθεσιμότητα του H2S μπορεί να είναι αποτέλεσμα μειωμένης έκφρασης του γονιδίου CTH που παράγει το ένζυμο σύνθεσης του H2S στο ενδοθήλιο. Η έκφραση του CTH μπορεί να επηρεάζεται από γενετικούς ή και επιγενετικούς παράγοντες.Σκοπός της διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο πιθανός αντι-αθηροσκληρωτικός / αντιφλεγμονώδης ρόλος του εξωγενούς H2S μελετώντας τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται σε αυτές τις διεργασίες, καθώς και η διερεύνηση πιθανών γενετικών και επιγενετικών συσχετίσεων του H2S σε αθηρωματικούς ασθενείς. Είναι γνωστό ότι η χειρουργική επέμβαση αορτοστεφανιαίας παράκαμψης (CABG) απευθύνεται σε ασθενείς με καλά τεκμηριωμένη και σοβαρή CAD. Ως εκ τούτου, η μελέτη της CAD σε έναν πληθυσμό ατόμων που έχουν υποστεί επέμβαση CABG, μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά και χρήσιμα συμπεράσματα σχετικά με την πιθανή γενετική αλλά και επιγενετική συσχέτιση της νόσου.Ενδοθηλιακά κύτταρα EAhy926 χρησιμοποιήθηκαν για το in vitro κυτταρικό μοντέλο προσομοίωσης της αθηρωμάτωσης και αναπτύχθηκαν σε καλλιεργητικά τριβλία των 12 φρεατίων. Τα κύτταρα παρέμειναν σε συνθήκες έλλειψης ορού και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις των δοτών H2S GYY4137 και θειογλυκίνης για 60min και μετά με ΤΝF-α (10ng/ ml) για 6h. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το καλλιεργητικό μέσο και πραγματοποιήθηκε συνεπώαση με τα μονοκύτταρα ΤΗΡ-1, 60min στους 37°C. Η προσκόλληση μετρήθηκε σε τυχαία επιλεγμένα πεδία του οπτικού μικροσκοπίου. Επιπρόσθετα, ολικό RNA απομονώθηκε από τα EAhy926 (τα οποία είχαν επωαστεί πρώτα με θειογλυκίνη και GYY4137 στις διάφορες συγκεντρώσεις για 60min και έπειτα με TNFα (10ng/ml) για 120min και δημιουργήθηκε το cDNA. Με τη βοήθεια της qPCR προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mRNA για τις πρωτεΐνες MCP-1 και ICAM1. Το καλλιεργητικό μέσο των EAhy926 συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των επιπέδων της εκκρινόμενης πρωτεΐνης ΜCP-1. Η έκφραση των επιπέδων των υπομονάδων της οξειδάσης NADPH ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση Western blotting, χρησιμοποιώντας ως γονίδιο αναφοράς αυτό της β-ακτίνης.Το αδιέγερτα ΕΑΗy926 κύτταρα έδειξαν ελάχιστη προσκόλληση μονοκυττάρων ΤΗΡ-1, ενώ η προσκόλληση των ΤΗΡ-1 αυξήθηκε σημαντικά στα διεγερμένα με ΤΝFα ΕΑHy926. Η επώαση των EAΗy926 με θειογλυκίνη για 60min προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της προσκόλλησης των ΤΗΡ-1 σε ποσοστό 48.2 ± 3.2% στη δόση των 500 μΜ (P = 0.001). Η επώαση με 300 μΜ και 500 μΜ GYY4137 για 60min πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε επίσης δοσοεξαρτώμενη αναστολή της προσκόλλησης των ΤΗΡ-1 σε ποσοστό 68.3% ± 2.5 (Ρ = 0.001). Τα επίπεδα mRNA της MCP-1 μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα EAΗy926 που συνεπωάστηκαν με ΤΝF-α και 500 μΜ GYY4137 (Ρ <0.001) ή και 500 μΜ θειογλυκίνης (Ρ <0.001), σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με ΤΝF-α. Τα επίπεδα mRNA του προσκολλητικού μορίου ICAM1 μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα EAΗy926 που συνεπωάστηκαν με ΤΝFα και 300 μΜ (Ρ = 0.041) και 500 μΜ θειογλυκίνης (Ρ<0.001) σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με ΤΝF-α. Αντίστοιχα, ο δότης GYY4137 έδειξε μια τάση μείωσης των επιπέδων mRNA του ICAM1 στη δόση 500 μΜ χωρίς όμως στατιστική σημαντικότητα. Επίσης τα επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτεΐνης MCP-1 έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη μείωση τόσο για το GYY4137 όσο και για τη θειογλυκίνη, αλλά χωρίς στατιστική σημαντικότητα. Όσον αφορά την έκφραση των υπομονάδων NADPH, τα επίπεδα της κυτταροπλασματικής p47phox και της φωσφορυλιωμένης ενεργοποιημένης υπομονάδας αυτής, phosphop47phox, αυξήθηκαν μετά από διέγερση με ΤΝFα (P = 0.02 και P = 0.035 αντίστοιχα), ενώ η έκφραση της βασικής μεμβρανικής υπομονάδας gp91phox παρέμεινε αμετάβλητη. Η επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων EAΗy926 με 500 μΜ θειογλυκίνης πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε μείωση της έκφρασης των υπομονάδων p47phox (P = 0.014) και της phosphop47phox (P = 0.028) συγκριτικά με τα κύτταρα EAΗy926 που επωάστηκαν μόνο με TNFα. Όσο αφορά το δότη GYY4137, η επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων EAΗy926 με 500 μΜ GYY4137 πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε μείωση της έκφρασης των υπομονάδων p47phox (P = 0.005) και της phosphop47phox (P = 0.043) συγκριτικά με τα κύτταρα EAΗy926 που επωάστηκαν μόνο με TNFα.Για τις γενετικές και επιγενετικές μελέτες χρησιμοποιήσαμε έναν πληθυσμό 334 ατόμων Καυκάσιας ελληνικής καταγωγής (178 άτομα με CAD που υποβλήθηκαν σε CABG και 156 άτομα της ομάδας ελέγχου). Στον πληθυσμό αυτό προσδιορίσαμε τις συχνότητες του πολυμορφισμoύ CTH 1364 G>T με τη χρήση της μεθόδου PCR-RFLP και επίσης μελετήσαμε το προφίλ μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου CTH χρησιμοποιώντας μια ποσοτική ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με βάση την SYBR Green (qMSP-PCR). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα των γονότυπων CTH 1364 G> T (P = 0.281) και των αλληλόμορφων (P = 0.265) μεταξύ των ασθενών με CABG και των ατόμων της ομάδας ελέγχου. Αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου CTH παρατηρήθηκαν στην ομάδα CABG (19.1%) συγκριτικά με τα άτομα της ομάδας ελέγχου (10.3%) (P = 0.024). Η ανάλυση ανά φύλο αποκάλυψε ότι η παραπάνω διαφορά παρατηρείται στους άνδρες (P = 0.032) αλλά όχι στις γυναίκες (P = 0.884). Χρησιμοποιώντας πολυπαραγοντική ανάλυση, μετά τη διόρθωση του στατιστικού μοντέλου για παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση CAD όπως το κάπνισμα, η ηλικία και το φύλο, διαπιστώθηκε ότι τα αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του CTH συσχετίστηκαν με την εμφάνιση CAD στο συνολικό δείγμα (OR = 2.163, 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI] 1.038-4.506, P = 0.039) και στους άνδρες (OR = 2.418, 95% CI 1.048-5.581, P = 0.039) αλλά όχι στις γυναίκες (OR = 0.542, 95% CI 0.094-3.140, P = 0.495).Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, το H2S τροποποεί διεργασίες που προάγουν τη φλεγμονή και την αθηρογένεση, αναστέλλοντας την προσκόλληση των μονοκυττάρων και εξασθενίζοντας την έκφραση των MCP-1 και ICAM1 σε φλεγμονώδη ενδοθηλιακά κύτταρα. Τόσο το GYY4137 όσο και η θειογλυκίνη μπορούν να διαδραματίσουν έναν πιθανό προστατευτικό ρόλο στην αθηροσκληρωτική παθογένεση, παρεμποδίζοντας την προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η θεραπεία με δότες H2S μπορεί να αποτελεί μια νέα προσέγγιση κατά της παθολογικής αυτής κατάστασης. Επιπλέον, οι δότες H2S φαίνεται να περιορίζουν τις γνωστές καταστροφικές επιδράσεις των αυξημένων επιπέδων ROS μέσω της τροποποίησης που ασκούν στο σηματοδοτικό μονοπάτι της οξειδάσης NADPH.Παρότι ο πολυμορφισμός του γονιδίου CTH 1364 G> T δεν συσχετίστηκε με CAD στον Καυκάσιο ελληνικό πληθυσμό, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, η υπερμεθυλίωση του CTH είναι ένας ανεξάρτητος προδιαθεσικός παράγοντας για εμφάνιση CAD μεταξύ των ανδρών. Από όσα γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που μελετά σε κλινικά δείγματα την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του υποκινητή του γονιδίου CTH σε σχέση με την εμφάνιση CAD. Συνολικά, τα ευρήματα που αναφέρονται σε αυτή τη διατριβή διευρύνουν περαιτέρω τις γνώσεις μας για τους ρόλους και τους μηχανισμούς με τους οποίους το H2S αλληλεπιδρά με την καρδιαγγειακή λειτουργία και την παθολογία του καρδιαγγειακού συστήματος. Η αποσαφήνιση των μοριακών, γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών στους οποίους εμπλέκεται το H2S μπορεί να συμβάλλει στην ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων με στόχο τη μείωση του καρδιαγγειακού κινδύνου μελλοντικά.