Φαινοτυπικά και γονοτυπικά χαρακτηριστικά των a-like proteins και b-proteins ως λοιμογόνων παραγόντων του β-αιμολυτικού στρεπτόκοκκου της ομάδας β, σε έγκυες και μη, γυναίκες στην Ελλάδα

Abstract

Αim: The aim of this thesis was the study, with molecular analysis techniques, of surface protein antigens prevalence (alp2/3, Rib, Alpha C, epsilon, bac), of Group B Streptococcus (GBS), as pathogenicity factors, the relevance with antibiotic resistance used during pregnancy, such as penicillin, ampicillin, clindamycin and vancomycin, the resistance in erythromycin in order to evaluate clindamycin resistance and the cross-correlation of these surface protein genes with resistance to antibiotics. Finally, the awareness of gynaecologists and microbiologists regarding the infection from GBS was investigated.Introduction: GBS constitutes one of the most frequent causes of infection and septicemia in neonates and is associated with high morbidity and mortality rates (5-20%) during the perinatal period.In 1996 the Centre for Disease Control (CDC) in USA published the first guidelines on the prevention of infection of neonates from GBS. However in 2002 CDC revised the guidelines. Despite the revised directives however and the recorded reduction of early-onset GBS disease in neonates, the CDC in 2010 moved towards a third revision. Moreover it was suggested that microbiologists must cultivate the material from vaginal and rectal samples in solid material like agarose gel, as well as, in a specially enriched broth.There has been a variety of pathogenicity factors identified on GBS, including the polysaccharide capsule, various regulating and surface proteins, as well as toxins. GBS strains are categorized in 10 basic types (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, and IX) on the basis of their polysaccharide capsule. These types are also related to C-antigen and other surface antigens.C-Antigen constitutes the first well studied antigen of GBS. Alpha-like proteins (Alp) are proteins that resemble to alpha-protein (α) and constitute the better studied team of surface proteins of GBS up to now.There have been areas on GBS DNA identified, called pathogenicity islands, that contain genes like bca, rib, alp2, alp3, alp4, alp1/alp5 and bac that encode alp and beta proteins and are related with the pathogenicity.Materials and methods: From 01/01/2016 until 01/01/2017, 5498 cultures of vaginal fluid from women between the ages 18 to 61 were collected. 2882 (52,4%) of them came from pregnant women and 2616 (47,6%) from non-pregnant. The study was focused in the molecular analysis of 128 strains of GBS from vaginal fluid cultures and their respective susceptibility tests (antibiograms). Sample collection and proccessing was performed according to CDC (2010) guidelines. The isolated strains of GBS were analyzed for isolation of the genes Alp2/3, AlphaC, Rib, bac and Epsilon with PCR. Visualization was performed on agarose gel (2%).Results: GBS was isolated in 9,8% of the general population of women in Greece, 12,4% among pregnant women and 6,9% among non-pregnant. In the strains of GBS coming from pregnant women the rib gene was isolated in 39,5%, the Alp2/3 gene 23,3%, the AlphaC gene 18,6%, the ε gene 18,6% and the bac gene 7%. The percentages of isolation of the genes rib, Alp2/3, AlphaC and ε, coming from strains of GBS of non-pregnant women were 16,3%, 28,7%, 19% and 19% respectively. The bac gene was not isolated. The resistence of all the GBS strains to erythromycin was 51,6% while that of clindamycin was 48,4%. The presence of the rib gene was also associated (21,8%) with resistance to erythromycin and clindamycin. Decreased sensitivity in penicillin was found in 0,76%. Inducible Clindamycin resistance was found to be 6%.Conclusions: The percentage of GBS isolation (9,8%) is lower than what is reported worldwide (8% until 18%), therefore according to our study Greece is among the countries with the lower percentage of GBS carrier rate. The strains isolated from pregnant women carried the Rib protein gene, and in continuity the Alp2/3, Alpha C, e, bac genes. The decreased sensitivity in penicillin was roughly 0,76%, indicating an augmentative tendency, thus a susceptibility test (antibiogram) should always be performed. The resistance in erythromycin of all isolated GBS strains was 51,6%, almost the same as that of clindamycin and it is highest rate that has ever been reported in Greece. It would be really beneficial if National Guidelines were published.

Σκοπός: Ο σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να μελετηθούν με μοριακή ανάλυση, ο επιπολασμός επιφανειακών πρωτεϊνικών αντιγόνων (alp2/3, Rib, Alpha C, epsilon, bac) του β-αιμολυτικού στρεπτοκόκκου της ομάδος Β (GBS), ως παθογόνων στοιχείων, η μελέτη αντοχής σε αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται στην κύηση για τη χημειοπροφύλαξη απο τον GBS όπως πενικιλλίνη, αμπικιλλίνη, κλινδακυκίνη, και βανκομυκίνη, η αντοχή στην ερυθρομυκίνη για αξιολόγηση της κλινδαμυκίνης και η συσχέτιση των γονιδίων των πρωτεϊνών επιφάνειας με τις αντοχές σε αντιβιοτικά. Τέλος διερευνήθηκε η ευαισθητοποίηση των γυναικολόγων και βιοπαθολόγων σχετικά με τη λοίμωξη και την προφύλαξη απο τον GBS.Εισαγωγή: Ο β-αιμολυτικός στρεπτόκοκκος της ομάδας Β (GBS) αποτελεί ένα από τα πιο συχνά αίτια λοίμωξης και σηψαιμίας των νεογνών και συνδέεται με σημαντική νοσηρότητα και θνητότητα (5-20%) κατά την περιγεννητική περίοδο.Το 1996 το κέντρο ελέγχου και πρόληψης ασθενειών (CDC) τωn HΠΑ δημοσίευσε τις πρώτες κατευθυντήριες οδηγίες για την πρόληψη λοίμωξης των νεογνών απο τον GBS. Ωστόσο το 2002 το CDC προχώρησε σε αναθεώρηση των οδηγιών Παρά τις αναθεωρημένες οδηγίες όμως και την καταγεγραμμένη μείωση της πρώιμης λοίμωξης των νεογνών απο GBS, το 2010 το CDC προχώρησε και σε τρίτη αναθεώρηση.Ο GBS παρουσιάζει ποικιλία λοιμογόνων παραγόντων όπως οι πολυσακχαρίτες της κάψας, ρυθμιστικές και επιφανειακές πρωτεΐνες καθώς και τοξίνες. Το C-αντιγόνο αποτελεί το πρώτο καλά μελετημένο επιφανειακό πρωτεϊνικό αντιγόνο του GBS. Οι alpha-like proteins (Alp) είναι πρωτεΐνες που μοιάζουν στην πρωτεΐνη α του C-αντιγόνου.Έχουν ανακαλυφθει στο DNA του GBS περιοχές (νησίδες παθογένειας) που περιέχουν γονίδια όπως τα bca, rib, alp2, alp3, alp4, alp1/alp5 και bac και σχετίζονται με την παθογένεια του GBS.Υλικά και μέθοδοι: Απο 01/01/2016 έως 01/01/2017 συλλέχθηκαν 5498 καλλιέργειες κολπικού υγρού (ΚΚΥ) απο γυναίκες ηλικίας 18 έως 61 ετών. 2882 (52,4%) από έγκυες γυναίκες και 2616 (47,6%) από μη έγκυες. Η μελέτη επικεντρώθηκε στη μοριακή ανάλυση (PCR) 128 στελεχών GBS από ΚΚΥ και στα αντιβιογράμματα με τις αντοχές τους. Η λήψη και επεξεργασία του υλικού έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του CDC (2010). Στα απομονωθέντα στελέχη του GBS έγινε ανίχνευση με PCR των γονιδίων Αlp2/3, AlphaC, Rib, bac και Epsilon και οπτiκοποίηση σε γέλη αγαρόζης (2%).Αποτελέσματα: Ο στρεπτόκοκκος Β απομονώθηκε σε ποσοστό 9,8% σε γενικό πληθυσμό γυναικών στην Ελλάδα, 12,4 % σε εγκύους και 6,9% σε μη εγκύους. Στα στελέχη από εγκύους απομονώθηκε το γονίδιο Rib σε ποσοστό 39,5% και ακολούθως το Alp2/3 23,3%, το Alpha C 18,6%, το ε 18,6% και το bac 7%. Στα στελέχη από μη-εγκύους απομονώθηκαν: Rib (16,3%), Alp2/3 28,7%, Alpha C 19%, ε 19% ενώ το bac δεν απομονώθηκε. Η αντοχή στην ερυθρομυκίνη σε όλα τα στελέχη μαζί ήταν περίπου 51,6% ενώ στην κλινδαμυκίνη 48,4%. Το γονίδιο Rib συνυπήρχε σε μεγάλο βαθμό (21,9%) με αντοχή στην ερυθρομυκίνη και την κλινδαμυκίνη μαζί. Η μειωμένη ευαισθησία στην πενικιλλίνη ανευρέθη σε ποσοστό 0,76%. Το ποσοστό επαγώγιμης αντοχής στην κλινδαμυκίνη ήταν 6%.Συμπεράσματα: Το ποσοστό φορείας μας (9,8%) είναι χαμηλότερο από αυτό που αναφέρεται παγκοσμίως ( 8% έως 18%). Σε μεγάλο ποσοστό τα στελέχη που απομονώθηκαν από εγκύους έφεραν το γονίδιο Rib. Η μειωμένη ευαισθησία στην πενικιλλίνη είναι περίπου 0,76%, δηλαδή παρουσιάζει αυξητική τάση και δείχνει πως πρέπει να πραγματοποιείται αντιβιόγραμμα πάντα. Η αντοχή στην ερυθρομυκίνη σε όλα τα στελέχη μαζί ήταν 51,6%, περίπου όσο και στην κλινδαμυκίνη και πρόκειται για μεγαλύτερο ποσοστό αντοχής του GBS που έχει αναφερθεί στην Ελλάδα.Θα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμη η έκδοση εθνικών κατευθυντήριων οδηγιών για την πρόληψη λοίμωξης απο τον GBS.