Σχεδιασμός σύνθεση και αξιολόγηση αναλόγων των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των προτεϊνών της μυελίνης που εμπλέκονται στη σκλήρυνση κατά πλάκας

Abstract

In this thesis the development of new compounds, analogues of myelin proteins immunodominant epitopes implicated in Multiple Sclerosis (MS) is reported. Two different strategies were studied, that could potentially serve as a basis for developing new approaches to addressing the disease. Peptide analogues based on the immunodominant epitopes MOG35-55 and MBP85-99 were synthesized.The first approach involves the tolerance of the immune system by dendritic cells, using peptide analogues conjugated to mannan polysaccharide (polymanose). The synthesized analogues were used in toxicological, in vivo and in vitro evaluation. The conjugation between the peptide and mannan was achieved using the decapeptide [KG]5 as a bridge. A methodology, based on SDS-PAGE was developed for the confirmation of conjugates and the determination of optimal coupling conditions. In addition, stability studies of Mannanoxidized-[KG]5MOG35-55(Pro42) was performed.The second approach involves the design synthesis and evaluation of a conjugate consisting of the MBP85-99 epitope and a modified anthraquinone molecule. The coupling was performed via an (Ahx)6 bridge and a disulfide bond, in order to achieve selective immunosuppression of the immune system. The synthesized analogue evaluated for its immunosuppressive activity on human cancer cell line Jurkat. Immunofluorescence studies were performed, to define its localization into cell and the role of the disulfide bond in combination with the action of thioredoxin reductase. The binding affinity of conjugate to HLA II DRΒ1-1501 protein was certified. Moreover, the protein was attempted to be expressed and isolated from the cell line HEK293, by recombinant DNA technique. A further study is the merger of conjugation to specific II HLA-tetramers, to be used for in vivo and in vitro experiments. The encephalitogenic T cells will hopefully recognize the peptide analogue merged in the tetramer, follow-on the approach of the immunosuppressive compound to these cells and may be lead them to apoptosis.

Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη νέων ενώσεων, αναλόγων των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης, που εμπλέκονται στη Σκλήρυνση Κατά πλάκας (ΣΚΠ). Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο διαφορετικές στρατηγικές, που πιθανώς θα μπορούσαν να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων στην αντιμετώπιση της ασθένειας. Για το σκοπό αυτό συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα με βάση τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους MOG35-55 και MBP85-99. Η πρώτη προσέγγιση στοχεύει στην ανοχή του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω των δενδριτικών κυττάρων, με τη χρήση πεπτιδικών αναλόγων συζευγμένων με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (πολυμανόζη). Τα συντιθέμενα ανάλογα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα τοξικολογικής, in vivo και in vitro αξιολόγησης. Πραγματοποιήθηκε σύζευξη πεπτιδικών αναλόγων στη μαννάνη μέσω μιας γέφυρας [KG]5. Αναπτύχθηκε μεθοδολογία SDS-PAGE για τον έλεγχο των συζευγμάτων, καθώς και για τον προσδιορισμό βέλτιστων συνθηκών σύζευξης. Επίσης πραγματοποιήθηκε μελέτη σταθερότητας του συζεύγματος Mannanoxidized-[KG]5MOG35-55(Pro42).Η δεύτερη προσέγγιση, περιλαμβάνει το σχεδιασμό τη σύνθεση και την αξιολόγηση ενός συζεύγματος που αποτελείται από τον επίτοπο MBP85-99 και τροποποιημένη ανθρακινόνη. Η σύζευξη πραγματοποιήθηκε μέσω μια γέφυρας (Ahx)6 και δισουλφιδικού δεσμού, με στόχο να επιτευχθεί επιλεκτική ανοσοκαταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος. Το συντιθέμενο ανάλογο αξιολογήθηκε για την ανασοκατασταλτική του δράση στην ανθρώπινη καρκινική σειρά Jurkat. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό του στο κύτταρο και για τον ρόλο του δισουλφιδικού δεσμού σε συνδυασμό με τη δράση της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης. Διαπιστώθηκε επιπλέον, η ικανότητα πρόσδεσης του συζεύγματος με την πρωτεΐνη HLA II DRΒ1-1501, η οποία έγινε προσπάθεια να εκφραστεί και να απομονωθεί από την κυτταρική σειρά HEK293, μέσω τεχνικής ανασυνδυασμένου DNA. Προέκταση της μελέτης αυτής είναι η ενσωμάτωση του συζεύγματος σε HLA II ειδικά-τετραμερή τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για in vivo και in vitro αξιολόγηση. Τα εγκεφαλιτογόνα Τ κύτταρα, δύναται να αναγνωρίσουν το πεπτιδικό ανάλογο το οποίο θα βρίσκεται σε τετραμερές, με αποτέλεσμα την προσέγγιση σε αυτά της ανοσοκατασταλτικής ένωσης που θα μπορούσε να τα οδηγήσει σε επιλεκτική ανοσοκαταστολή.