Μοριακή και γενετική ανάλυση του γονιδίου AtAPRF1 (Arabidopsis thaliana Anthesis Promoting Factor) και λειτουργικός ρόλος στην ανάπτυξη των φυτών

Abstract

WDR proteins are widespread in eukaryotes and mediate a variety of regulatory interactions in eukaryotic cells, while they are rarely present in prokaryotes. WDRs play a crucial role in controlling intracellular molecular interactions through the co-operative formation of protein complexes, by acting as scaffolding proteins. Interactome studies suggest that three dimensional shape of β-propeller lends functionality to WDRs. The β– propeller architecture of WD Repeat proteins (WDRs) is formed by 4-16 short tandemrepeat units (WD40-motifs). Each WD40 repeat consists of a 40 amino acids core region that include a conserved GH dipeptide in N-terminus and a signature WD dipeptide in the C-terminus. The proteome of A. thaliana contains c. 269 WDRs, categorized into 143 distinct families. In current PhD thesis, a combination of molecular and genetic approacheshave been implemented to characterize the function of APRF1 (ANTHESIS POMOTING FACTOR 1) gene in A. thaliana and to investigate its role in plant development, while its involvement in setting the flowering time is postulated.The gene locus At5g14530 (named here in APRF1), which is organized in 10 exons and 9 introns, encodes for a low molecular weight protein, concisting from 330 aminoacids and containing seven WD40 repreats, that form the structural WD40 region of the protein. Bioinformatic analysis revealed that APRF1 is a conserved protein, sharing High amino acid identity across the plant kingdom. Interestingly, APRF1 exhibits also a High degree of sequence similarity (52%) and structural homology with the Swd2 subunit of the yeast COMPASS complex.To obtain insights into the subcellular distribution of the APRF1 protein, a YFP:APRF1 translational fusion construct was generated. The analysis revealed that APRF1 is a nuclear protein, as evidenced by the strong fluorescent YFP signal emitted from the nucleoplasm did not mark the nucleolar region of the nuclei. APRF1 was strongly expressed throughout seedling development. The analysis of GUS reporter activity in independent transgenic lines, revealed that during seed development APRF1 was strongly expressed in the endosperm and the developing embryo, whereas after germination, expression was prominent in the aerial part of the seedlings, in cotyledons, including the vascular system, the hydathodes and the trichomes, as well as in young leaves and the incipient leaf primordia. APRF1 was not expressed in the upper part ofthe hypocotyl, the primary root tip (including the elongation zone) and the lateral root primordial. Moreover, expression of APRF1 was prominent during the reproduction phase in the developing pollen grains, the anther tissues and the filaments, while after fertilization, it was found to be expressed mainly in the placenta and the abscission zone of the siliques. Additionally, semi-quantitative RT-PCR analysis was employed, in order to investigate the expression pattern of APRF1. In consistency with the GUS reporter gene expression analysis, semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that APRF1 was strongly expressed in all tissues tested, whereas the highest mRNA levels were observed in leaves and flowers.To evaluate the functional importance of APRF1 in plant development, two independent T-DNA transgenic lines were phenotypically analyzed. APRF1 mRNA depletion enhanced the vegetative growth of the plants and delayed flowering. APRF1 impaired plants developed faster and exhibited vegetative growth alterations. In both mutants, rosette leaves had extended petioles and a quite undulating surface, compared to WT. They became larger, more elongated and they displayed a slight increase in serration depth, while their margins rolled inward, towards the midrib on the underside. Due to the prolonged vegetative phase, mutant plants displayed at the initiation of their reproductive phase large rosettes with numerous leaves and flower buds. Compared to WT plants, total loss-of-function aprf1 mutants exhibited shoot apical meristem (SAM) alterations and increased growth rates. However, the vegetative phase of aprf1 plants was prolongedand bolting was delayed, indicating an impairment in flowering under long days (LD). On the contrary, overexpression of APRF1 accelerates flowering. Furthermore, semi-thinsections of shoot apices showed that both the SAM width and the cell number were slightly decreased in the over-expression line. Taken together, the early flowering phenotype can be attributed to the increased APRF1 transcript levels, which were also able to reverse the late flowering phenotype of aprf1 mutants. A further analysis was conducted, by measuring the time margins of specific developmental indicators in the populations of the different genetic backgrounds (WT, aprf1-9 and 35S:APRF1). The APRF1 compromised plants displayed not only a delay in flowering, but also an extended flowering duration. Arabidopsis thaliana flowering time mutants revealed the function of numerous genes that regulate the transition from vegetative to reproductive growth. Analyses of their loci have shown that many of them act as chromatin modifiers. Considering the late flowering phenotype of aprf1 and the structural similarity of APRF1 with the yeast Swd2 subunit of the COMPASS histone methylation complex, the possibility whether the observed phenotypes were caused by misregulation of the flowering time loci was investigated. qPCR was employed to evaluate the expression levels of the major flowering time genes FLC, SOC1, CO and FT, in WT and aprf1 plants under LD. The analysis revealed that FLC transcript levels were extremely elevated in mutant plants at all time points. The results of current PhD thesis suggest that APRF1 acts upstream of FLC and promotes flowering under Long Day photoperiod. These results support the view that flowering of aprf1 was hindered by the elevated expression of FLC and that APRF1 is probably involved in an FLC downregulation mechanism to accelerate flowering. As APRF1 shows significant sequence and structural homology to Swd2 the functional conservation between the two orthologs was investigated. APRF1 protein displays functional homology to the Swd2 protein, an essential subunit for the yeast histone methylation COMPASS complex, as well as for the CPF complex, necessary for mRNA3΄ end processing.

Το WD40 δομικό μοτίβο αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα δομικά μοτίβα του πρωτεώματος των ευκαρυωτών, ενώ σπάνια συναντάται σε προκαρυωτικής προέλευσης πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες που περιέχουν τουλάχιστον τέσσερις WD40 επαναλήψεις (WDR πρωτεΐνες) συγκροτούν στο χώρο τη χαρακτηριστική τριτοταγή δομή της β-προπέλας, η οποία τους προσδίδει ρόλο ικριώματος, δηλαδή την ικανότητα να προσφέρουν την επιφάνεια για την επιτέλεση μοριακών αλληλεπιδράσεων και τη συγκρότηση πολύπλοκων πρωτεϊνικών συμπλόκων. Εξαιτίας του γεγονότος ότι οι WDR πρωτεΐνες λειτουργούν ως κομβικές υπομονάδες ενδοκυτταρικών αλληλεπιδράσεων, διευκολύνοντας τις διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, αλλά και τις αλληλεπιδράσεις DNA‑πρωτεϊνών, αποτελούν τα τελευταία χρόνια αντικείμενο εντατικής μελέτης και έρευνας. Το πρωτέωμα του Arabidopsis thaliana περιέχει μια ιδιαίτερα πολυπληθή υπεροικογένεια WDR πρωτεϊνών που αριθμεί 269 μέλη, κατηγοριοποιημένα σε 143 οικογένειες. Παρ’ όλα αυτά, ένας μικρός αριθμός φυτικών WDR πρωτεϊνών έχουν χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα σε μοριακό και λειτουργικό επίπεδο. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, με τη συνδυαστική εφαρμογή μοριακών και γενετικών προσεγγίσεων, διερευνήθηκε ο αναπτυξιακός και λειτουργικός ρόλος του γονιδίου APRF1(ANTHESIS PROMOTING FACTOR1) από το Arabidopsis thaliana, καθώς και η εμπλοκή του στους μοριακούς μηχανισμούς που επάγουν την άνθιση. Το γονίδιο APRF1 εδράζεται στο γενετικό τόπο 14530 του πέμπτου χρωμοσώματος και κωδικοποιεί για μια WDR πρωτεΐνη 330 αμινοξέων με πειραματικά προσδιορισμένο μοριακό βάρος 37 kD. Η βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε ότι η APRF1 αποτελείται από επτά WD40 δομικές επαναλήψεις, όπως και η ορθόλογή της, Swd2, από τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, ενώ η στοίχιση της αμινοξικής της αλληλουχίας με άλλες ορθόλογες φυτικές αλληλουχίες κατέδειξε το υψηλό ποσοστό ταυτότητας μεταξύ τους. Ο υψηλός βαθμός συντήρησης της εν λόγω πρωτεΐνης στο φυτικό πρωτέωμα υποδεικνύει το σημαντικό μοριακό της ρόλο όχι μόνο στο Arabidopsis, αλλά πιθανότατα και σε άλλα φυτικά είδη. Η φυλογενετική ανάλυση υπέδειξε, ότι η APRF1 τοποθετείται μαζί με τις υπόλοιπες φυτικές ορθόλογες πρωτεΐνες σε ένα κοινό κλάδο, διαφορετικό από αυτόν των ζώων και των μυκήτων, υποδηλώνοντας πως η διαφορά στην αμινοξική τους αλληλουχία είναι ανάλογη της εξελικτικής προέλευσης των οργανισμών. Η APRF1 παρουσιάζει επίσης υψηλό ποσοστό αμινοξικής ταυτότητας με την ULCS1 από Arabidopsis thaliana, η οποία,ωστόσο, τοποθετείται σε διαφορετικό υποκλάδο εντός του φυλογενετικού κλάδου των φυτών. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το ότι σε όλα τα φυτικά γονιδιώματα που εξετάστηκαν εντοπίζονται δύο τουλάχιστον στενά συσχετιζόμενες αλληλουχίες που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες υψηλού ποσοστού ταυτότητας. Αντίθετα, στα γονιδιώματα των ζώων φαίνεται πως οι αντίστοιχες APRF1 ορθόλογες πρωτεΐνες δεν έχουν άλλα ομόλογα μέλη. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την ομαδοποίηση των δύο φυτικών ομόλογων πρωτεϊνών σε διαφορετικούς υποκλάδους του δέντρου, υποδηλώνει ότι προήλθαν εξελικτικά από το διπλασιασμό ενός αρχέγονου γονιδίου μετά τη διάσχιση φυτών και ζώων από τον κοινό τους πρόγονο. Προκειμένου να εντοπιστεί η υποκυτταρική τοπολογία της APRF1, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά φυτά που φέρουν κατασκευές μεταφραστικής σύντηξης του APRF1 μετο γονίδιο αναφοράς YFP (yellow fluorescent protein). Η μικροσκοπική παρατήρηση επιδερμικών κυττάρων ρίζας και τριχιδίων σε διαγονιδιακά φυτά έδειξε, ότι η πρωτεΐνη APRF1 εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα των κυττάρων και δη στο πυρηνόπλασμα και όχι στον πυρηνίσκο. Με τη μέθοδο της ημι-ποσοτικής RT-PCR προσδιορίστηκε ότιτο APRF1 εκφράζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της βλαστητικής ανάπτυξης των νεαρών αρτιβλάστων, ενώ στις ρίζες τα μέγιστα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου εντοπίζονται πέντε ημέρες μετά τη φύτρωση των σπερμάτων. Διαγονιδιακές σειρές που φέρουν την κατασκευή της μεταγραφικής σύντηξης του υποκινητή του γονιδίου APRF1 με το γονίδιο αναφοράς GUS (β-glucuronidase), δημιουργήθηκαν και αναλύθηκαν, προκειμένου να μελετηθεί λεπτομερώς το in planta ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου APRF1. Κατά την ανάπτυξη του σπέρματος, παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου στο ενδοσπέρμιο και το αναπτυσσόμενο έμβρυο. Μετά τη φύτρωση, το APRF1 εκφράζεται έντονα στα υπέργεια τμήματα των νεαρών αρτιβλάστων και πιο συγκεκριμένα στις κοτυληδόνες και το αγωγό τους σύστημα, στα νεαρά φύλλα και στα τριχίδια τους, καθώς και στη βάση του υποκοτυλίου. Με τη μικροσκοπική ανάλυση κατά μήκος τομών σε αρτίβλαστα διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων, διαπιστώθηκε έκφραση του γονιδίου στο ακραίο μερίστωμα του βλαστού, αλλά και στο αγωγό σύστημα, όπως στα παρεγχυματικά κύτταρα ξυλώματος και στο φλοίωμα. Σημαντική έκφραση του γονιδίου παρατηρήθηκε και στον κεντρικό κύλινδρο της ρίζας, αλλά όχι στο ακρόριζο και στο ακραίο μερίστωμα της ρίζας. Το APRF1 παρουσιάζει επίσης μία εξειδικευμένη έκφραση κατά την αναπαραγωγική φάση ανάπτυξη των φυτών, όπου εντοπίζεται χρώση κατά GUS στους αναπαραγωγικούς ιστούς των στημόνων, τη ζώνη απόσχισης και τον πλακούντα των ωοθηκών και αναπτυσσόμενων κερατίων. Στη διαδικτυακή βάση δεδομένων SALK εντοπίστηκαν δύο ανεξάρτητες διαγονιδιακές σειρές, που φέρουν την T-DNA ένθεση στο ένατο εξώνιο και εσώνιο, αντίστοιχα, του APRF1. Οι σειρές αυτές αποκτήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Αρχικά, η τοπολογία της ένθεσης επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, ενώ στη συνέχεια δημιουργήθηκαν ομόζυγες σειρές για κάθε T-DNA ένθεση, οι οποίες και αναλύθηκαν ως προς την απουσία μεταγραφημάτων του APRF1 και υποβλήθηκαν σε λεπτομερή φαινοτυπική μελέτη. Υπό φωτοπερίοδο μακράς ημέρας (16h φως ), η χρονική διάρκεια της βλαστητικής ανάπτυξης των ολικής απώλειας λειτουργίας διαγονιδιακών σειρών, είναι επιμηκυμένη κατά 10 περίπου ημέρες εν συγκρίσει με αυτή των φυτών αγρίου τύπου. Ο φαινότυπος αυτός οδηγεί και σε μία αντίστοιχη χρονική υστέρηση της ανθοφορίας, γεγονός που καθιστά τα φυτά aprf1 μεταλλάγματα χρόνου-άνθισης. Η χρονικά καθυστερημένη μετάβαση των μεταλλαγμάτων στην αναπαραγωγική φάση και η παρατεταμένη παραμονή τους στη βλαστητική φάση, έχει αντίκτυπο και σε μια σειρά επιπρόσθετων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Τα φυτά aprf1 παρουσιάζουν αυξημένο αριθμό και μέγεθος φύλλων ροζέτας, καθώς επίσης και αυξημένες βιομετρικές παραμέτρους που σχετίζονται με τη συνολική νωπή ή ξηρή βιομάζα και τον αριθμό των κερατίων και παραγόμενων σπερμάτων. Όταν τα aprf1 εισέρχονται στην αναπαραγωγική φάση ανάπτυξης, σχηματίζουν ανθοφόρο βλαστό που περιβάλλεται στη βάση του από διπλάσιο αριθμό φύλλων ροζέτας και φέρει πρωτογενή ταξιανθία με ιδιαίτερα αυξημένο αριθμό ανθέων, σε σχέση με τα αγρίου τύπου φυτά. Σημαντικά αυξημένος είναι και ο αριθμός των άμισχων φύλλων και μασχαλιαίων μεριστωμάτων ταξιανθίας που δημιουργούνται πάνω στον πρωτογενή βλαστό. Ωστόσο, ιδιαίτερο και ταυτόχρονα μοναδικό φαινοτυπικό χαρακτηριστικό των aprf1 μεταλλαγμάτων, σε σχέση με τα ήδη χαρακτηρισμένα μεταλλάγματα χρόνου‑άνθισης στο Arabidopsis, είναι ο αυξημένος ρυθμός ανάπτυξης τους. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι οι παραπάνω φαινοτυπικές και αναπτυξιακές μεταβολές συνδέονται άμεσα με την απώλεια λειτουργίας του APRF1, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακές σειρές εκτοπικής υπερέκφρασης του γονιδίου, τόσο σε γενετικό υπόβαθρο φυτών αγρίου τύπου, όσο και μεταλλαγμάτων aprf1. Η ανάλυση των διαγονιδιακών σειρών έδειξε ότι η υπερέκφραση του APRF1, ακόμη και σε στο γενετικό υπόβαθρο της ολικής απώλειας λειτουργίας aprf1 μεταλλάγματα, οδηγεί σε αναστροφή του μεταλλαγμένου φαινοτύπου. Οι διαγονιδιακές σειρές υπερέκφρασης παρουσιάζουν φαινότυπο πρόωρης άνθισης, κατά πέντε έως επτά ημέρες, σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Η αναστροφή του μεταλλαγμένου φαινοτύπου επιβεβαιώθηκε όχι μόνο σε σχέση με το χρόνο άνθισης των φυτών, αλλά και σε συνάρτηση με τις λοιπές βιομετρικές παραμέτρους αύξησης. Τα φυτά υπερέκφρασης εμφανίζουν μειωμένο αριθμό φύλλων ροζέτας, κερατίων και σπερμάτων, μειωμένη νωπή και ξηρή βιομάζα, καθώς επίσης και συνολικά βραχύτερο βιολογικό κύκλο ζωής. Η συγκριτική μελέτη της αρχιτεκτονικής του ακραίου μεριστώματος του βλαστού σε διαγονιδιακές σειρές ολικής απώλειας λειτουργίας APRF1 (aprf1 μεταλλάγματα) και εκτοπικής υπερέκφρασης του APRF1, έδειξε ότι παρουσιάζουν αυξημένο και μειωμένο αριθμό κυττάρων L1 στιβάδας, αντίστοιχα, σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Τα τελευταία χρόνια, έχει εντοπιστεί και χαρακτηριστεί πληθώρα γονιδίων που εμπλέκονται στα μοριακά μονοπάτια που επάγουν την άνθιση στο Arabidopsis. Τα μονοπάτια επαγωγής της άνθισης διακρίνονται σε αυτό των γιββερελλινών, της φωτοπεριόδου, της ανίχνευσης της ποιότητας του φωτός, στο αυτόνομο και στο μονοπάτι της εαρινοποίησης. Με τη μέθοδο της ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο RT‑PCR (RealTime Reverse Transcription PCR), μελετήθηκαν τα επίπεδα των μεταγραφημάτων για αρκετά από τα γονίδια των παραπάνω μοριακών μονοπατιών, τόσο στο γενετικό υπόβαθρο των μεταλλαγμάτων, όσο και σε αυτό των φυτών υπερέκφρασης και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα των φυτών αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το APRF1 δρα αναρροϊκά του γονιδίου FLC. Σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια που ελέχθησαν, η απουσία μεταγραφημάτων του APRF1 οδηγεί σε αύξηση κατά περίπου δέκα φορές των επιπέδων έκφρασης του FLC, η επαγωγή του οποίου είναι γνωστό ότι παρεμποδίζει την άνθιση δια μέσω της καταστολής του γονιδίου SOC1. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, αλλά και με το μακροσκοπικό φαινότυπο της καθυστερημένης άνθισης, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SOC1 παραμένουν μειωμένα στα μεταλλάγματα καθ’ όλη τη διάρκειατης βλαστητικής τους φάσης. Αντιθέτως, κατά την μετάβαση των μεταλλαγμάτων στηναναπαραγωγική φάση, τα επίπεδα του SOC1 αυξάνονται ετεροχρονισμένα, πιθανότατα εξαιτίας της ενεργοποίησης των άλλων μοριακών μονοπατιών, τα οποία λειτουργούνως «ασφαλιστικές δικλίδες» προκειμένου να εξασφαλιστεί η επιτυχή μετάβαση των φυτών στην ανθοφορία. Η διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου CO σταμεταλλάγματα (που αποδέχεται τα μοριακά σινιάλα από το μονοπάτι της φωτοπεριόδου) επιβεβαίωσε την υπόθεση αυτή, καθώς βρέθηκε ότι εμφανίζονται αυξημένα κατά την άνθιση. Τα επίπεδα των μεταγραφημάτων του γονιδίου FT, που συνδυαστικά με το SOC1 ενεργοποιεί τα γονίδια ανθικής μεριστωματικής ταυτότητας, δεν παρουσιάζουν σημαντική μεταβολή στα aprf1 φυτά, γεγονός που υποδεικνύει πως η απώλεια λειτουργίαςτου APRF1 δεν επηρεάζει τη γονιδιακή ρύθμιση του συγκεκριμένου γενετικού τόπου.Κατά την πειραματική προσέγγιση της λειτουργικής διερεύνησης του γονιδίου APRF1, χρησιμοποιήθηκε και το ετερόλογο σύστημα της ζύμης σε πείραμα συμπληρωματικότητας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η APRF1 είναι λειτουργικά ομόλογη της Swd2 τουSaccharomyces cerevisiae, καθώς είναι ικανή να διασώσει τον θνησιγόνο φαινότυπο του θερμοευαίσθητου στελέχους απώλειας λειτουργίας της Swd2. Η Swd2 είναι γνωστό ότι αποτελεί απαραίτητη υπομονάδα του συμπλόκου COMPASS μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 στο αμινοξικό κατάλοιπο Κ4. Η Η3Κ4 μεθυλίωση αποτελεί μηχανισμό τροποποίησης των ιστονών των νουκλεοσωμάτων και σχετίζεται άμεσα με την επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Δεδομένου του ότι η γονιδιακή ρύθμιση του FLC συντελείται σε επιγενετικό επίπεδο, στο σύνολό τους τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η APRF1 προάγει την άνθιση στο Arabidopsis, πιθανότατα δια μέσω της εμπλοκής της σε σύμπλοκα επιγενετικής καταστολής του γονιδίου FLC.