Μοριακή και γενετική ανάλυση γονιδίων του αγωγού συστήματος και ο λειτουργικός τους ρόλος στην ανάπτυξη του φυτού arabidopsis thaliana

Abstract

In the plant body, the vascular system is centrally localized and consists of two distinct types of tissues, the xylem and phloem. Its development in A. thaliana occurs in four main processes: specification, establishment, maintenance and differentiation. This conductive tissue initiates as procambium during the stage of the early globular embryo and develops into xylem and phloem cells in later embryogenesis by the activation of discrete signaling pathways. However, the final differentiation of the discrete cell types occurs post-embryonically, when sieve elements modify their cell walls and undergo selective autolysis, and tracheary elements finalize the processes of secondary cell wall deposition, programmed cell death, autolysis and lignification. At maturity, sieve elements have thickened primary cell walls composed of cellulose, hemicelluloses, pectins and proteins. Tracheary element secondary cell walls, on the other hand, consist of cellulose, hemicelluloses and lignin, which convert the vessels into functional conductive tissues, suitable for water transport. The coordination of cambium maintenance and its subsequent differentiation into phloem and xylem cells is accomplished by the TDIF-TDR signaling pathway. The vascular system provide mechanical support and facilitate the transport of water, nutrients and long distance developmental signals, which are vital for plant growth. It is also involved in the transport and/or biosynthesis of signaling molecules that enable plant responses to biotic and abiotic stress. Furthermore, the paper and biofuel industry relies mainly on the lignocellulosic biomass, which is derived predominantly from the thickened cell walls of secondary xylem cells. Thus, the mechanisms underlying the development of the vascular system and in particular tracheary elements differentiation, has attracted considerable interest from researchers in the last decades. Primary studies included in planta analysis of entire multicellular organisms, which had many restrictions. However, the development of in vitro cell culture systems, the progress of forward and reverse genetics as well as the microarrays technology, have significantly contributed in broadening our knowledge in this field. Methods such as chromatin and protein complexes immunoprecipitation as well as the advanced cell culture systems (VISUAL) had a significant impact in recent years towards the identification of biochemical pathways and regulatory networks which contribute in plant vascular development. Nevertheless, many aspects of these mechanisms remain unclear and the list of proteins involved is far from being complete.In this research, we investigated the functional role of VPNB1 and RASD1, which encode for two proteins of unknown function in Arabidopsis thaliana. Although these genes are expressed predominantly in the vascular system, the data presented herein demonstrate that the two genes have distinct roles during plant development. VPNB1 encodes for an armadillo repeat containing protein, exclusively expressed in cambium, xylem and phloem cells. Subcellular localization experiments indicate that VPNB1 is localized within nucleoplasmic speckle-like structures, which are not related to cajal bodies. In silico analysis of the VPNB1 promoter sequence revealed the presence of a number of cis-regulatory elements related to tracheary and sieve elements differentiation, such as SMRE, SNBE, M46RE and E-boxes. The in planta analysis confirmed that these transcription factor binding sites, and in particular the SMRE and SNBE, are crucial for VPNB1 trancriptional activation. In line with the above data, the analysis of vpnb1 mutants revealed that the total loss-of-function lines exhibit a delayed growth phenotype and a non-canonical pattern of xylem and phloem tissues in root and shoot cross sections. In contrast, the overexpression lines exhibit an increased growth phenotype, accompanied by an elevated deposition of xylem and phloem cell layers. In accordance with these data, quantitative RT-PCR analysis showed a deregulation of several important regulatory genes involved in secondary cell wall biosynthesis, such as NST1, MYB46, MYB58, IRX5, IRX8 and IRX12. Taken together, the above results imply the involvement of VPNB1 in the maintenance and/or differentiation of the different cell types, and underline its important role in plant vascular development. RASD1 on the other hand, which encodes for a C2 domain CAR like protein, exerts its function in the vascular system probably as a components of a signal transduction pathway. The use of a combination of molecular, genetic and physiological approaches revealed that RASD1 is localized in the nucleus and the periphery of plant cells, while rasd1 mutant lines are compromised in their responsiveness to ABA. This insensitive phenotype to the plant growth regulator ΑΒΑ, renders the total knock-out mutants sensitive to drought stress and resistant to salinity stress. As demonstrated by quantitative measurements of the relative water loss (RWL) and the relative water content (RWC) in detached rosette leaves and entire seedling, respectively, the RASD1 impaired plants are drought sensitive both during seed germination and plant growth. Similarly, the rasd1 mutants are resistant to salinity stress. Taken together, these data indicate that RASD1 is involved in ABA-related signal transduction pathways, which enables the plant to respond to ABA and activate the related stress adaptation mechanisms.

Το αγωγό σύστημα των φυτών είναι εσωτερικά τοποθετημένο στο φυτικό σώμα και αποτελείται από δύο ξεχωριστούς ιστούς, το ξύλωμα και το φλοίωμα. Η ανάπτυξή του περιλαμβάνει την εξειδίκευση, την εγκαθίδρυση, τη συντήρηση και τη διαφοροποίηση των επιμέρους κυττάρων του. Οι διεργασίες αυτές ξεκινούν με κοινά σηματοδοτικά μονοπάτια κατά την εμφάνιση του καμβίου στην εμβρυογένεση, στο στάδιο του πρώιμου σφαιρικού εμβρύου και στη συνέχεια διαχωρίζονται σε διακριτά μονοπάτια στους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Κατά την τελική διαφοροποίηση που λαμβάνει χώρα μετεμβρυακά, τα ηθμώδη στοιχεία τροποποιούν τα κυτταρικά τους τοιχώματα και υφίστανται επιλεκτική αυτόλυση, ενώ στα τραχειακά στοιχεία επιτελούνται οι διεργασίες της εναπόθεσης δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος, του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, της αυτόλυσης και της λιγνινοποίησης. Τα ηθμώδη άρθρα περιλαμβάνουν παχυμένα πρωτογενή κυτταρικά τοιχώματα τα οποία αποτελούνται από κυτταρίνη, ημικυτταρίνες, πηκτίνες και πρωτεΐνες ενώ τα δευτερογενή κυτταρικά τοιχώματα των τραχειακών στοιχείων αποτελούνται από κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη που μετατρέπουν τα υδαταγωγά στοιχεία σε συμπαγείς και άκαμπτους σωληνοειδείς σχηματισμούς κατάλληλους για τη μεταφορά νερού. Το μονοπάτι των TDIF-TDR συντονίζει τη διατήρηση του καμβίου και τη διαφοροποίησή του σε κύτταρα φλοιώματος και ξυλώματος.Ο ρόλος του αγωγού συστήματος περιλαμβάνει τη μεταφορά του νερού και των οργανικών και ανόργανων θρεπτικών συστατικών που είναι ζωτικής σημασίας για τα φυτά και την ανάπτυξή τους. Επίσης, ο αγωγός ιστός στηρίζει το φυτικό σώμα και συμμετέχει στην μεταφορά ή/και τη βιοσύνθεση σηματοδοτικών μορίων, μεταξύ των οποίων και σήματα απόκρισης του φυτού σε βιοτική και αβιοτική καταπόνηση. Η χρήση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, που προέρχεται κατά κύριο λόγο από τα παχυμένα δευτερογενή κυτταρικά τοιχώματα του δευτερογενούς ξυλώματος, στη βιομηχανία παραγωγής χαρτιού και βιοκαυσίμων, έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον των ερευνητών εδώ και πολλές δεκαετίες και έχει εντατικοποιήσει τις μελέτες των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη του αγωγού συστήματος και κυρίως τη διαφοροποίηση των τραχειακών στοιχείων. Ενώ οι αρχικές μελέτες περιελάμβαναν in planta αναλύσεις και παρατηρήσεις σε ολόκληρους πολυκύτταρους οργανισμούς και σε in vitro συστήματα κυτταροκαλλιεργειών, οι προσεγγίσεις αυτές είχαν αρκετούς περιορισμούς. Ωστόσο, η ανάπτυξη των μεθοδολογιών της προς τα εμπρός και αντίστροφης γενετικής όπως επίσης και των μεθοδολογιών των μικροσυστοιχιών, έχουν συντελέσει στην ταυτοποίηση αρκετών πρωτεϊνών και στη διαλεύκανση βιοχημικών μονοπατιών και ρυθμιστικών δικτύων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του αγωγού συστήματος. Μεθοδολογίες όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης, η ανοσοκατακρήμνιση συμπλόκων και το σύστημα κυτταροκαλλιέργειας VISUAL, έχουν δώσει σημαντική ώθηση τα τελευταία χρόνια στην καλύτερη κατανόηση των επιμέρους μοριακών μονοπατιών και ρυθμιστικών δικτύων που εμπλέκονται στα στάδια διαφοροποίησης των τραχειακών και ηθμωδών στοιχείων του αγωγού συστήματος. Ωστόσο, παρ’ όλη την πρόοδο που έχει επιτευχθεί στον συγκεκριμένο τομέα, πολλές πτυχές των παραπάνω μηχανισμών παραμένουν ασαφείς και χρήζουν περαιτέρω επιστημονικής έρευνας. Στην παρούσα έρευνα, μελετήθηκε ο αναπτυξιακός ρόλος των γονιδίων VPNB1 και RASD1 από το Arabidopsis thaliana, τα οποία κωδικοποιούν για πρωτεΐνες άγνωστης μέχρι σήμερα λειτουργίας. Τα συγκεκριμένα γονίδια, αν και εκφράζονται στο αγωγό σύστημα, παρουσιάζουν διακριτούς ρόλους σε αυτό. Το VPNB1 κωδικοποιεί για μία armadillo επαναλαμβανόμενη πρωτεΐνη, η οποία εκφράζεται αποκλειστικά στο αγωγό σύστημα και συγκεκριμένα στο κάμβιο και στα διαφοροποιούμενα κύτταρα του ξυλώματος και του φλοιώματος. Πειράματα υποκυτταρικής τοπολογίας έδειξαν ότι η VPNB1 είναι εντοπισμένη σε πυρηνοπλασμικές δομές, που δεν σχετίζονται με τα cajal bodies. Η in silico ανάλυση του υποκινητή αποκάλυψε την παρουσία ρυθμιστικών στοιχείων που απαντούν σε υποκινητές γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση τραχειακών και ηθμωδών στοιχείων, όπως τα SMRE, SNBE, M46RE και E-boxes, ενώ η in planta μελέτη του επιβεβαίωσε τη συμμετοχή των στοιχείων αυτών στην επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου VPNB1. Τα μεταλλάγματα vpnb1 παρουσιάζουν ένα φαινότυπο καθυστερημένης ανάπτυξης και ένα μη κανονικό πρότυπο ξυλώματος, ενώ σε εγκάρσιες τομές της ρίζας παρατηρείται αποδιοργάνωση του προτύπου του κεντρικού κυλίνδρου. Σε αντίθεση, οι σειρές υπερέκφρασης παρουσιάζουν έναν αντίστροφο φαινότυπο αυξημένης ανάπτυξης, που συνοδεύεται από αυξημένη εναπόθεση φλοιωματικών και ξυλωματικών κυτταρικών στοιβάδων. Σε συμφωνία με τα παραπάνω δεδομένα, ποσοτική PCR ανάλυση αποκάλυψε την απορρύθμιση της έκφρασης διαφόρων σημαντικών γονιδίων ρυθμιστών της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς τοιχώματος, όπως τα NST1, MYB46, MYB58, IRX5, IRX8 και IRX12, υπογραμμίζοντας την εμπλοκή της VPNB1 στη ρύθμιση της διαφοροποίησης του αγωγού ιστού της ρίζας και του βλαστού. Το γονίδιο RASD1 (RESPONSIVENESS TO ABA SALT AND DROUGHT 1) κωδικοποιεί για μία C2-δομικών μοτίβων CAR-όμοια πρωτεΐνη που εκφράζεται κυρίως στο αγωγό σύστημα του Arabidopsis. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του στην ανάπτυξη του φυτού, εφαρμόστηκε ένας συνδυασμός μοριακών, γενετικών και φυσιολογικών προσεγγίσεων. Τα δεδομένα υπέδειξαν ότι η RASD1 εντοπίζεται στον πυρήνα και στην περιφέρεια του κυττάρου, ενώ τα rasd1 μεταλλάγματα δεν αποκρίνονται στο εξωγενές ABA. Ο μη ευαίσθητος αυτός φαινότυπος στον φυτοαυξητικό ρυθμιστή ΑΒΑ καθιστά τα ολικής απώλειας μεταλλάγματα ευαίσθητα στην καταπόνηση από ξηρασία και ανθεκτικά στην καταπόνηση από NaCl, τόσο κατά τη διάρκεια της φύτρωσης των σπερμάτων όσο και κατά την ανάπτυξη. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η RASD1 εμπλέκεται σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος που σχετίζονται με το ABA, ως ένας πιθανός σημαντικός ρυθμιστής, ο οποίος καθιστά ικανά τα φυτά να ενεργοποιούν μηχανισμούς που σχετίζονται με τη φύτρωση των σπερμάτων και την ανάπτυξη τους σε αβιοτικές καταπονήσεις.