Mechanisms of muscle function: the effect of uremia on morphology, metabolism and fatigue

Abstract

Introduction: Chronic kidney disease (CKD) patients present with an increase of waste products in the blood (uremia) which are purported to impact on skeletal muscle causing “uremic myopathy” (incl. abnormalities such as atrophy, especially in fast muscle types, weakness, fat infiltration, peripheral neuropathy, excess acidosis and premature fatigue). A number of patient interventions implemented so far, while greatly beneficial have failed to fully correct for muscular deficits. A host of comorbidities adds complexity to the interpretation of existing results, while most research has examined the end-stage of the disease and it is thus not known how and if skeletal muscle is affected at earlier stages of disease progression. This research aimed to examine the effect of chronic renal insufficiency on skeletal muscle’s force generation capacity using an animal model of pre-dialysis CKD. Therefore, to reveal if sarcomeric function per se may be affected by chronic renal insufficiency, the single muscle fiber’s force generation capacity was examined at resting conditions as well as in response to acidosis, its calcium sensitivity and its resilience in the face of redox challenges, by examining:1.force generation of isolated muscle fiber preparations in conditions mimicking the resting state ( Study 1)2.force generation of isolated muscle fiber preparations in conditions mimicking acidosis ( Study 1)3.force-pCa relationship of isolated muscle fiber preparations in conditions mimicking the resting state (Study 2)4.force-pCa relationship of isolated muscle fiber preparations in conditions mimicking acidosis (Study 2)5.stretch activation kinetics relationship of isolated muscle fiber preparations in conditions mimicking the resting state (Study 3)6.morphology of isolated muscle fiber preparations (Study 1 and Study 3)7.force generation of isolated muscle fiber preparations in conditions of acute redox imbalance (Study 4)Materials and Methods: Renal insufficiency was induced surgically in New Zealand rabbits (UREM), with sham-operation for controls (CON), using ethically approved procedures. At 3 months post-surgery, following euthanasia, psoas muscle samples were excised, chemically skinned and stored in 50% glycerol solution at -20oC until mechanical assessment using an SI Heidelberg/WPI micro dynamometer. Fibers’ diameters were recorded using the eyepiece of a stereoscope. Sample treatments, dissection and all evaluations were conducted in a blind fashion.Study 1. Isometric forces (Po) were recorded from maximally calcium activated single fibers (N=142 CON; N=240 UREM) at ‘standard’ baseline conditions (pH 7, 10oC), and at a near physiological temperature (pH 7, 30oC) in a subset of fibers; the effect of acidosis (pH 6.2) was also evaluated. Study 2. Isometric force was assessed in single psoas fibers (N=128 CON; N=195 UREM) in various concentrations of calcium, at 10oC, 30oC and at pH 7 and pH 6.2. To facilitate comparison, force data expressed as percentage (%) of Po at 10oC and pH 7 and free calcium expressed in pCa values were fitted in the Hill equation. The value of pCa where 50% relative force was achieved (pCa50), was used as an index of calcium sensitivity. Cooperativity was represented by the nH value of the fit.Study 3: Single psoas fibers (N=21 CON; N=42 UREM) were maximally activated under isometric conditions at 22°C, pH7. When force reached a plateau, step-like stretches of 0.3% fiber length were performed to induce isometric force transients. The time to the peak of stretch-induced delayed force increase (t₃) was evaluated as a measure of cross-bridge kinetics. Resting sarcomere lengths were also determined at a near slack position by laser diffraction. Study 4. Single psoas fibers’ (N=18 CON; N=19 UREM) force response to redox changes [employing Hydrogen Peroxide (H2O2) and/or Dithiothreitol (DTT)] was assessed in 2 experimental sets: A) Acute exposure to 10mM H2O2 during full activation followed by incubation in 10mM DTT during relaxation and a subsequent activation in standard solutions (N=9 CON; N=9 UREM fibers); B) Exposure to 10mM H2O2 during relaxation, preceded and followed by submaximal (pCa50) and maximal activations in standard solutions (N=9 CON; N=10 UREM fibers).Results: The results of the current thesis are summarized below:Study 1. Renal insufficiency resulted in significantly smaller average CSA for UREM muscle fibers compared to CON (by ~11%, P<0.01). At standard conditions UREM fibers produced lower absolute and specific forces (P<0.01); this force disparity remained also when measurements were performed at 30oC (P<0.01). For both groups, acidosis significantly reduced force production (vs pH 7, 10oC, P<0.01), with a similar percent force decline (UREM -48% vs CON -43%, P>0.05). Study 2. At standard conditions (10oC, pH7), UREM fibers presented with quite similar calcium sensitivity (pCa50 UREM 6.12±0.02 vs CON 6.20±0.03) and cooperativity compared to CONs (nH UREM 2.11±0.14 vs CON 2.36±0.3). Acidosis (pH 6.2) at 10oC caused a loss of calcium sensitivity for both groups, more so for UREM (pCa50 UREM 5.32±0.06 vs CON 5.58±0.02). At 30oC pH7, UREM fibers presented with lower sensitivity than CON (pCa50 UREM 6.00±0.25 vs CON 6.42±0.19). At 30oC acidosis reduced calcium sensitivity similarly for both groups (pCa50 UREM 5.71±0.13 vs CON 5.80±0.05). Study 3. Fibers of the UREM animals exhibited larger t₃ values (UREM 67±18 ms vs CON 57±16 ms; P<0.05). Furthermore, UREM fibers exhibited larger resting sarcomere lengths (UREM 2.25±0.33 µm vs CON 2.05±0.17 µm; P<0.01) and smaller mean diameters (UREM 70±19 µm vs CON 79±13 µm; P<0.05). Study 4. A) Acute exposure to H2O2 during activation did not affect force generation (P>0.05). DTT pre-incubation caused 12% force reduction (P>0.05) only in UREM fibers B) H2O2 during relaxation reduced subsequent maximal isometric forces in the Pool of fibers (UREM and CON) by 3.5% (P<0.05) but not in fiber groups separately (UREM P>0.05; CON P>0.05).Discussion: Chronic renal insufficiency induced significant impairments in single psoas muscle fiber force that were only partially explained by atrophy. Further investigation is warranted to pinpoint the contributions of possible changes in sarcomeric protein properties to the evident functional deficit (Study 1). It appears that chronic renal insufficiency may depress calcium sensitivity, the magnitude of this depression being dependent on prevailing experimental conditions. It is important to consider temperature and acidosis parameters when assessing calcium sensitivity in chronic disease (Study 2). Chronic renal insufficiency can induce a slowing of myosin head cross-bridge kinetics and remodelling changes concerning fiber diameters (atrophy) and sarcomere structure. The larger sarcomere lengths in fibers of UREM animals could be due to a decrease of forces restoring the sarcomere length at resting conditions (Study 3). Force generation capacity of CON and UREM fibers is affected by oxidation similarly. However the observation that UREM muscle may have been in a more reduced state at baseline warrants further investigation as it could be linked to disease induced effects (Study 4).Conclusion: For the first time, contractile properties of uremic muscle were assessed at the single fiber level. Evaluation of maximal isometric force, force-pCa relationship and stretch activation kinetics revealed important functional limitations in uremic fibers which were partly accounted for by atrophy. The elastic elements of the sarcomere could also be affected and explain some results. Extrapolating to the human condition, we suggest that even at a pre-dialysis stage, chronic renal insufficiency can severely disturb a muscle’s force generating capacity at the single fiber level. Our findings provide new information to help explain muscle weakness and fatigue in CKD.

Εισαγωγή: Στην Χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ), οι ασθενείς παρουσιάζονται με αυξημένη συγκέντρωση παραπροϊόντων του μεταβολισμού (ουραιμία) τα οποία φαίνεται να επηρεάζουν αρνητικά τον σκελετικό μυ προκαλώντας «ουραιμική μυοπάθεια» (συμπερ. διαταραχές όπως ατροφία κυρίως σε μυϊκό ιστό ταχείας συστολής, αδυναμία, λιπώδης διήθηση, περιφερική νευροπάθεια, αυξημένη οξέωση και πρόωρη κόπωση). Μια σειρά παρεμβάσεων που έχουν εφαρμοστεί στην συγκεκριμένη κλινική ομάδα ενώ έχουν φανεί ευεργετικές, δεν έχουν καταφέρει να διορθώσουν επαρκώς το λειτουργικό έλλειμμα των ασθενών. Δεδομένης της συννοσηρότητας που παρουσιάζεται στην νόσο, η ερμηνεία αυτών των αποτελεσμάτων γίνεται πολύπλοκη ενώ οι περισσότερες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε ασθενείς τελικού σταδίου. Ως εκ τούτου δεν είναι γνωστό το αν και με ποιό τρόπο επηρεάζονται οι σκελετικοί μύες σε προγενέστερα στάδια της εξέλιξης της νόσου.Σκοπός της συγκεκριμένης έρευνας ήταν να εξεταστεί η επίδραση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας στον σκελετικό μυ ως προς την ικανότητα παραγωγής δύναμης, χρησιμοποιώντας ένα ζωικό μοντέλο προ-τελικού σταδίου ΧΝΝ. Με σκοπό λοιπόν να διαπιστωθεί εάν η καθαυτή σαρκομερική λειτουργία μπορεί να επηρεάζεται από την χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, εξετάστηκε η ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες ηρεμίας αλλά και στην ανταπόκριση σε συνθήκες οξέωσης, στην ευαισθησία στο ασβέστιο αλλά και στην ικανότητα λειτουργικής ανταπόκρισης σε οξειδοαναγωγικές μεταβολές, εξετάζοντας:1. την ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 1). 2. την ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες οξέωσης (Μελέτη 1). 3. την σχέση δύναμης-pCa απομονωμένων μυϊκών ινών σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 2). 4. την σχέση δύναμης-pCa απομονωμένων μυϊκών ινών σε συνθήκες οξέωσης (Μελέτη 2). 5. την ανταπόκριση απομονωμένων μυϊκών ινών σε αιφνίδιες αλλαγές του μήκους τους σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 3). 6. την μορφολογία απομονωμένων μυϊκών ινών (Μελέτες 1 και 3).7. την ικανότητα λειτουργικής ανταπόκρισης απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες οξείας πρόκλησης οξειδοαναγωγικών μεταβολών (Μελέτη 4). Μεθοδολογία: Η νεφρική ανεπάρκεια προκλήθηκε χειρουργικά σε κονίκλους Νέας Ζηλανδίας (UREM) ενώ πραγματοποιήθηκε εικονική χειρουργική επέμβαση για τους κονίκλους της ομάδας ελέγχου (CON). Τρεις μήνες μετά την χειρουργική παρέμβαση και ύστερα από την ευθανασία των ζώων, πραγματοποιήθηκε συλλογή ψοΐτη μυϊκού ιστού. Ακολούθησε χημική απομεμβράνωση του ιστού και στην συνέχεια τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε διάλυμα 50% γλυκερόλης στους -20οC, μέχρι την μηχανική τους αξιολόγηση με την χρήση εξειδικευμένου μικροδυναμομέτρου (SI Heidelberg/WPI). Οι διάμετροι των ινών αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσοφθάλμιο φακό ενός στερεοσκοπίου. H επεξεργασία των δειγμάτων, ο διαχωρισμός και όλες οι αξιολογήσεις διεξήχθησαν σε έναν τυφλό σχεδιασμό. Μελέτη 1. Πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της μέγιστης ισομετρικής δύναμης (Po) (Ν=142 CON, N=240 UREM) σε ‘standard’ συνθήκες (pH7, 10oC), και σε θερμοκρασίες πλησίον των φυσιολογικών (pH7, 30oC) σε μια υποομάδα ινών• αξιολογήθηκε επίσης η επίδραση της οξέωσης (pH 6.2).Μελέτη 2. Η ισομετρική δύναμη απομονωμένων μυϊκών ινών ψοΐτη (N=128 CON, N=195 UREM) αξιολογήθηκε σε ένα εύρος συγκεντρώσεων ασβεστίου στους 10oC, 30oC αλλά και σε pH 7 και pH 6.2. Για να διευκολυνθεί η σύγκριση, τα δεδομένα της δύναμης εκφράστηκαν ως ποσοστό (%) των τιμών Po στους 10oC και pΗ 7 και το ελεύθερο ασβέστιο εκφράστηκε σε τιμές pCa. Αυτές οι τιμές κατόπιν προσαρμόστηκαν στην εξίσωση Hill. Η τιμή pCa στην οποία επιτεύχθηκε το 50% της σχετικής δύναμη (pCa50) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της ευαισθησίας στο ασβέστιο. Η συνεργατικότητα αντανακλάται στις τιμές nΗ. Μελέτη 3: Οι απομονωμένες ίνες ψοΐτη (Ν=21 CON, Ν=42 UREM) ενεργοποιήθηκαν μέγιστα υπό ισομετρικές συνθήκες στους 22°C, pΗ 7. Όταν η δύναμη σταθεροποιήθηκε, προκλήθηκε αιφνίδια επιμήκυνση των ινών κατά 0,3% του αρχικού τους μήκους ώστε να προκληθούν αλλαγές στην παραγόμενη δύναμη. Ο χρόνος που χρειάστηκε από την έναρξη της επιμήκυνσης μέχρι την κορύφωση της καθυστερημένης αύξησης της δύναμης (t₃), αξιολογήθηκε ως δείκτης της κινητικής των εγκάρσιων γεφυρών. Τα σαρκομερικά μήκη ηρεμίας των ινών προσδιορίστηκαν επίσης σε θέση που οι ίνες βρίσκονταν σε χάλαση, με περίθλαση λέιζερ.Μελέτη 4. Η λειτουργική ανταπόκριση απομονωμένων ινών ψoΐτη (Ν=18 CON, Ν=19 UREM) σε οξειδοαναγωγικές μεταβολές [υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και/ή Διθειοθρεϊτόλη (DTT)] αξιολογήθηκε σε 2 πειραματικές ομάδες: Α) Οξεία έκθεση σε 10mM Η2Ο2 κατά τη διάρκεια πλήρους ενεργοποίησης που ακολουθείται από επώαση σε 10mM DTT κατά την διάρκεια χάλασης και την επακόλουθη ενεργοποίηση σε “standard” διαλύματα (Ν=9 CON, Ν=9 UREM) Β) Έκθεση σε 10mM Η2Ο2 κατά τη διάρκεια της χάλασης, πριν και μετά από υπομέγιστες (pCa50) και μέγιστες ενεργοποιήσεις σε “standard” διαλύματα (Ν=9 CON, Ν=10 UREM).Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής εργασίας συνοψίζονται παρακάτω:Μελέτη 1. Η νεφρική ανεπάρκεια οδήγησε σε σημαντικά μικρότερη εγκάρσια διατομή (CSA) τις UREM μυϊκές ίνες συγκριτικά με τις CON (κατά ~ 11%, Ρ<0.01). Σε “standard” συνθήκες οι UREM ίνες παρήγαγαν χαμηλότερες απόλυτες και ειδικές δυνάμεις (διορθωμένες ως προς CSA) σε σύγκριση με τις CON (P<0.01). Αυτή η διαφορά στην δύναμη παρέμεινε, επίσης, όταν οι μετρήσεις έγιναν στους 30°C (P<0.01). Και για τις δύο ομάδες, η οξέωση μείωσε σημαντικά την παραγωγή δύναμης (vs pH7, 10oC P<0.01), με ένα παρόμοιο ποσοστό μείωσης (UREM -48% vs CON -43%, P>0.05).Mελέτη 2. Σε “standard” συνθήκες, οι UREM ίνες παρουσιάστηκαν με παρόμοια ευαισθησία στο ασβέστιο (pCa50 UREM 6.12±0.02 vs CON 6.20±0.03) και συνεργατικότητα (nΗ UREM 2.11±0.14 vs CON 2.36±0.3). H oξέωση (pH6.2), στους 10°C προκάλεσε απώλεια της ευαισθησίας του ασβεστίου και για τις δύο ομάδες, κυρίως όμως για τις UREM (pCa50 UREM 5.32±0.06 έναντι CON 5.58±0.02). Στους 30oC, pΗ7, οι UREM ίνες παρουσιάστηκαν με χαμηλότερη ευαισθησία από ό,τι οι CON (pCa50 UREM 6.00±0.25 έναντι CON 6.42±0.19). Στους 30oC, η οξέωση μείωσε την ευαισθησία στο ασβέστιο, παρόμοια και για τις δύο ομάδες (pCa50 UREM 5.71±0.13 έναντι CON 5.80±0.05).Μελέτη 3. Οι UREM ίνες παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές t₃ (UREM 67±18 ms έναντι CON 57±16 ms, P<0.05). Επιπλέον, οι UREM ίνες εμφάνισαν μεγαλύτερα σαρκομερικά μήκη ηρεμίας (UREM 2.25±0.33 μm έναντι CON 2.05±0.17 μm, Ρ<0.01) και μικρότερες διαμέτρους (UREM 70 ± 19 μm έναντι CON 79 ± 13 μm, Ρ<0.05).Μελέτη 4. Α) Η οξεία έκθεση σε Η2Ο2 κατά την ενεργοποίηση δεν επηρέασε την παραγωγή δύναμης (P>0.05). Ωστόσο, το DTT προκάλεσε σημαντική μείωση της δύναμης κατά 12% (P<0.05) μόνο στις UREM ίνες. Β) Η επώαση με Η2Ο2 κατά τη διάρκεια της χάλασης μείωσε την μέγιστη ισομετρική δύναμη στο σύνολο των ινών (CON και UREM) κατά 3.5% (P<0.05), αλλά όχι στις 2 ομάδες ινών ξεχωριστά (UREM P>0.05; CON P>0.05). Συζήτηση: Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια προκάλεσε σημαντικές διαταραχές στην δύναμη απομονωμένων μυϊκών ινών ψοΐτη που μόνο εν μέρει μπορούν να εξηγηθούν από την μυϊκή ατροφία. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να εντοπίσει την συμβολή πιθανών μεταβολών στις σαρκομερικές πρωτεΐνες στο εμφανές λειτουργικό έλλειμμα (Μελέτη 1). Φαίνεται ότι η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια μπορεί να μειώσει σημαντικά την ευαισθησία στο ασβέστιο, και το μέγεθος αυτής της μείωσης εξαρτάται από τις πειραματικές συνθήκες. Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη η σημασία της θερμοκρασίας και της οξέωσης κατά την αξιολόγηση της ευαισθησίας του ασβεστίου σε χρόνιες ασθένειες (Μελέτη 2). Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια μπορεί επίσης να προκαλέσει επιβράδυνση στην κινητική των εγκάρσιων γεφυρών των κεφαλών της μυοσίνης καθώς και μεταβολές όσον αφορά την διάμετρο των ινών (ατροφία) και την δομή του σαρκομερίου. Τα μεγαλύτερα σαρκομερικά μήκη στις ίνες των UREM ζώων θα μπορούσαν να οφείλονται σε μείωση των δυνάμεων αποκατάστασης του σαρκομερικού μήκους σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 3). Η ικανότητα παραγωγής δύναμης των CON και UREM ινών επηρεάστηκε από την οξείδωση παρόμοια. Ωστόσο, η παρατήρηση ότι οι UREM ίνες μπορεί να βρίσκονταν σε μια πιο αναγωγική κατάσταση κατά την έναρξη των πειραμάτων χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση, καθώς αυτό θα μπορούσε να συνδέεται με την επίδραση της ασθένειας (Μελέτη 4).Συμπεράσματα: Για πρώτη φορά, αξιολογήθηκαν οι συσταλτικές ιδιότητες του ουραιμικού μυός σε επίπεδο απομονωμένων μυϊκών ινών. Η αξιολόγηση της μέγιστης ισομετρικής δύναμης, της σχέσης δύναμης-pCa και της ανταπόκρισης των ινών σε αιφνίδια επιμήκυνση, αποκάλυψε σημαντικούς λειτουργικούς περιορισμούς στις UREM ίνες που εν μέρει εξηγούνται από την ατροφία. Τα ελαστικά στοιχεία του σαρκομερίου θα μπορούσαν επίσης να επηρεαστούν και να εξηγήσουν κάποια αποτελέσματα. Μεταφέροντας τα αποτελέσματα στην ανθρώπινη κατάσταση, υποδεικνύουμε ότι ακόμη και σε ένα προ-τελικό στάδιο, η ΧΝΝ μπορεί να διαταράξει σοβαρά την ικανότητα παραγωγής δύναμης ενός μυός σε επίπεδο μυϊκής ίνας. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες πληροφορίες για την ερμηνεία της μυϊκή αδυναμίας και πρόωρης μυϊκής κόπωσης στη ΧΝΝ.