Μελέτη παραμέτρων φλεγμονής του εντερικού βλεννογόνου στο σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου

Abstract

This thesis aimed to investigate the underlying etiological mechanisms that have been implicated in the development of irritable bowel syndrome (IBS). Toll-like Receptors (TLRs) are a family of transmembrane innate immune receptors that recognize various bacterial and viral cell components and regulate immune response. The potential role of TLRs in the pathogenesis of the syndrome was addressed. Furthermore, an additional purpose of the study was to gather biometrical data regarding the IBS population and to investigate correlations of disease duration and stool pattern with patient’s quality of life. A total of 45 IBS patients and 25 healthy controls were included in the study population. 44 participants underwent colonoscopy and from 33 mucosal biopsies were obtained from the right colon. TLR expression was measured with real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Total RNA was isolated and was reversed transcribed to cDNA and quantification of TLR2, TLR4 and TLR8 mRNA levels was achieved by RQ-PCR. Quality of life questionnaires, Rome III criteria and stool pattern questionnaires were completed by all participants. The statistical analysis was performed with Shapiro – Wilk test in order to determine whether there was a parametric or non-parametric variant. Student’s t-test or Mann – Whitney test were implemented accordingly. There were no significant differences between the healthy controls (HC) and the IBS patients regarding age, body mass index and height. IBS patients were subdivided in IBS-C group (23%), IBS-D (57%) and IBS-M (13%). TLR2, TLR4 and TLR8 mRNA expression were increased in IBS patients compared to control though there was no statistical significance. IBS-D patients had elevated TLR4 expression (p=0.008) compared to HC and IBS-C patients had decreased TLR4 (p=0.027) and TLR8 expression (p=0.011). Furthermore, IBS-D patients presented with increased TLR2 and TLR4 mRNA expression compared to IBS-C patients (p=0.018 and p=0.005). Disease duration was positively correlated with TLR expression in the intestinal mucosa (TLR2 r=0.572 p=0.008 – TLR4 r=0.623 p=0.01 – TLR8 r=0.670 p=0.001) and negatively correlated with patients quality of life (r= -0.461 p=0.01). In addition, in IBS-D patients, TLR4 expression was negatively correlated with patients quality of life (r= -0.912 p=0.001) while Bristol stool scale in IBS patients and patients quality of life (r= -0.663 p=0.004) was also correlated. In this study, expression of TLR2, TLR4 and TLR8 were investigated from intestinal mucosal biopsies from the right colon in IBS patients. Increased levels of TLRs were documented though the IBS group had no significant statistical difference from HC. TLR4 was over expressed in IBS-D patients and on the contrary IBS-C patients presented with decreased expression of TLR4. Furthermore, TLR2 and TLR4 were increased significantly in IBS-D patients compared with IBS-C subgroup. Disease duration was negatively correlated with patient’s quality of life regardless of IBS subgroup. Finally, there was some evidence to support a predominantly inflammatory process occurring locally, at the intestinal mucosa. In order to better understand the complex IBS pathogenesis, specific immune response pathways should be investigated and understood in depth in well-designed experimental studies.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο τη διερεύνηση αιτιολογικών μηχανισμών στην ανάπτυξη του συνδρόμου ευερέθιστου εντέρου (ΣΕΕ). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκαν οι toll-like receptors (TLRs), μια ομάδα πρωτεϊνών οι οποίες δρουν ως υποδοχείς της φυσικής ανοσίας και προάγουν τη φλεγμονή. Επιπλέον σκοπός της μελέτης ήταν η μελέτη του πληθυσμού των ατόμων με ΣΕΕ, η συλλογή των βιομετρικών τους δεδομένων και η συσχέτιση παραμέτρων όπως η διάρκεια της νόσου και η συχνότητα των κενώσεων, με την ποιότητα ζωής των ασθενών. Συμμετείχαν στη μελέτη 45 ασθενείς με ΣΕΕ και 25 υγιείς μάρτυρες. Από αυτούς οι συνολικά 44 υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση με λήψη βιοψιών από το δεξί κόλον και τελικά στους 33 απομονώθηκε υλικό για τη μέτρηση των TLRs. Όλοι οι συμμετέχοντες συμπλήρωσαν τα ερωτηματολόγια για α) τη διάγνωση του ΣΕΕ (κριτήρια της Ρώμης ΙΙΙ), β) την ποιότητα ζωής και γ) τη σύσταση των κοπράνων (κλίμακα Bristol). Από το ιστολογικό υλικό απομονώθηκε το RNA και συντέθηκε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης των TLR2, TLR4 και TLR8 με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR). Στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων εφαρμόστηκε το Shapiro – Wilk test για να καθοριστεί αν η μεταβλητή ακολουθεί την κανονική κατανομή ή όχι. Ακολούθως χρησιμοποιήθηκαν το student’s t-test ή το Mann – Whitney test, ανάλογα με την κανονικότητα ή όχι της εκάστοτε μεταβλητής, για να ελεγχθεί αν υπάρχει κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ηλικία, το βάρος, το ύψος και τον δείκτη μάζας σώματος (ΒΜΙ) μεταξύ των ασθενών και των μαρτύρων. Η πλειοψηφία των ασθενών έπασχε από ΣΕΕ με διαρροϊκές κενώσεις (57%), το 23% εμφάνισε ΣΕΕ με δυσκοιλιότητα και το 13% ΣΕΕ μεικτού τύπου. Η έκφραση των TLR2, TLR4 και TLR8 ήταν αυξημένη στο σύνολο των ασθενών, χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Οι ασθενείς με διάρροιες εμφάνισαν αύξηση της έκφρασης του TLR4 (p=0,008) σε σχέση με τους μάρτυρες και οι ασθενείς με δυσκοιλιότητα μειωμένη έκφραση του TLR4 (p=0,027) και του TLR8 (p=0,011). Επιπλέον, οι ασθενείς με διαρροϊκές κενώσεις παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των TLR2 και TLR4 σε σχέση με τους ασθενείς με δυσκοιλιότητα (p=0,018 και p=0,005 αντίστοιχα). Η χρονική διάρκεια του ΣΕΕ παρουσίασε θετική συσχέτιση με την έκφραση των TLRs στο βλεννογόνο (TLR2 r=0,572 p=0,008 – TLR4 r=0,623 p=0,01 – TLR8 r=0,670 p=0,001) και αρνητική γραμμική συσχέτιση με την ποιότητα ζωής των ασθενών (r= -0,461 p=0,01). Παράλληλα, συσχετίστηκε αρνητικά η έκφραση του TLR4 στους ασθενείς με διάρροιες με την ποιότητα ζωής (r= -0,912 p=0,001) και η βαθμολογία στην κλίμακα κοπράνων του Bristol με την ποιότητα ζωής (r= -0,663 p=0,004). Σε αυτή τη έρευνα μελετήθηκε η έκφραση των TLRs στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου με βιοψίες από το δεξιό κόλον και παρατηρήθηκαν αυξημένες τιμές στους ασθενείς με ΣΕΕ, αν και δεν επιτεύχθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο σύνολο τους σε σχέση με τους μάρτυρες. Η έκφραση του TLR4 ήταν στατιστικά αυξημένη στους ασθενείς με διαρροϊκές κενώσεις και αντιθέτως μειωμένη στους ασθενείς με δυσκοιλιότητα. Οι υποομάδες των ασθενών παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τους, στην έκφραση των TLR2 και TLR4. Επιβεβαιώθηκε η αρνητική επίδραση της χρονιότητας του συνδρόμου στην ποιότητα της ζωής των ασθενών και αναδείχτηκε η σημασία της δυσλειτουργίας της ανοσιακής απάντησης και των μονοπατιών της φλεγμονής στην ανάπτυξη του ΣΕΕ.