Μελέτη του αμφιβληστροειδούς χιτώνος κατά την εξελικτική πορεία της αθηρωμάτωσης: πειραματική μελέτη

Abstract

Atherosclerosis is a systematic disease in which patchy deposits of fatty material (atheromas or atherosclerotic plaques) develop in the walls of medium-sized and large arteries, leading to reduced or blocked blood flow. The retina is one of the multiple organs that can be affected.Age related macular degeneration (ARMD) is the leading cause of irreversible blindness among older people. Several studies have suggested that increased dietary fat and cholesterol uptake, as well as oxidative stress may play a role in the pathogenesis of ARMD. In addition, recent studies have shown that hypercholesterolemia and lipid metabolism disorders may cause functional, morphological and ultrastructural changes in the retina such as vacuolation, thickening and breaks of the bruch’s membrane (BM).Recent studies have shown a protective effect of various antioxidants, such as vitamins C and E, flavonoids and multivitamin mineral complexes against retinal oxidative stress and ultrastructural retinal changes in animal models of genetic hypercholesterolemia.The aim of this project is to investigate the potential protective effect of aqueous extract of crocus sativus stigmas (saffron) in the retina of apolipoprotein E (apoE)- deficient mice fed a high cholesterol diet. Previous studies have shown the neuroptotective and anti-ischemic role of crocus sativus, leading to the hypothesis that crocus sativus (saffron) as a dietary factor may reduce the effects of hypercholesterolemia in the retina. Three groups of seven mice each were used. The first one, (control group) consisted of wild C57bl6 mice which were fed regular mouse chow. The second group(apo-E) consisted of apoE – deficient mice fed a high cholesterol diet. Apo E deficient mice is a well studied animal model of atheromatosis. They develop spontaneously hypercholesterolemia, high LDL blood levels, and atherosclerotic lesions similar to those developed in the human vascular system. The third group (apo-E+C) consisted of seven apoE – deficient mice fed a high cholesterol diet and saffron supplement. In the third group 25mg/kg of body weight of saffron was administered in drinking water. After 20 weeks time the animals were sacrificed by euthanasia and the ocular bulbs were enucleated. For each animal one or two eyes were fixed for histological analysis in optical microscope. At the start and at the end of the experiment blood samples were collected for biochemical analysis of lipidemic profile, oxidative stress and inflammatory markers. Analysis included total serum cholesterol, serum triglycerides, low density lipoprotein (LDL), lipid peroxides (perOX), leptin, and C reactive protein (CRP).The histological analysis included examination of the retina under optical microscope, digitizing of the histological images and digital processing of the images in order to estimate the thickness of the retina and the retinal layers, as well as the cell density of the outer nuclear layer of the retina.Statistical analysis was then performed in order to examine correlations that support the hypothesis of this project.The results showed that in apo-E+C group the blood glucose levels were similar to those of control group, while apo-E group had elevated levels. Furthermore, the body weight of apo-E group was elevated in contrast to apo-E+C group. The histological analysis showed a lower cell density in outer nuclear layer ONL, as well as a thinning in ganglion cell layer in apo-E group, in contrast to apo-E+C group which did not differ significantly from the control group. These findings lead to the conclusion that Crocus Sativus had a protective effect against retinal changes due to hypercholesterolemia and it also reduced the glucose levels and body weight to the corresponding animal group.

Η αθηρωμάτωση είναι μια συστηματική νόσος στην οποία σχηματίζονται πλάκες στα τοιχώματα των αρτηριών που προκαλούν στένωση του αυλού του αγγείου, πάχυνση του τοιχώματός τους, ελάττωση της ελαστικότητας του αγγείου με επακόλουθη πρόκληση ισχαιμίας. Μεταξύ των οργάνων που μπορούν να προσβληθούν περιλαμβάνεται και ο αμφιβληστροειδής χιτώνας του οφθαλμού, με δραματικές επιπτώσεις, καθώς συχνά οδηγεί σε απώλεια της όρασης. Παρόλο που έχουν γίνει εκτεταμένες έρευνες για την αθηρωμάτωση στο καρδιαγγειακό σύστημα, η έρευνα στον τομέα της οφθαλμολογίας είναι σχετικώς περιορισμένη.Πρόσφατες μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η υπερχοληστερολαιμία και οι διαταραχές στον μεταβολισμό των λιπιδίων προκαλούν λειτουργικές και δομικές αλλοιώσεις στη λεπτή υφή του αμφιβληστροειδούς, όπως πάχυνση και διάτμηση της μεμβράνης του Bruch, σχηματισμό κενοτοπίων στο μελάγχρουν επιθήλιο κ.α.Στην εξέλιξη της αθηρωμάτωσης συμβάλλουν πολλοί παράγοντες, όπως η αρτηριακή υπέρταση, ο διαβήτης, η υπερλιπιδαιμία, καθώς και η οξείδωση των λιπιδίων. Το οξειδωτικό stress έχει συσχετισθεί με διάφορες εκφυλιστικές παθήσεις του οφθαλμού που σχετίζονται με την ηλικία, όπως η αθηρωμάτωση και η γεροντική εκφύλιση της ωχράς κηλίδος, μιας νόσου που αποτελεί την κυριότερη αιτία τύφλωσης στις αναπτυγμένες χώρες και οι παθογενετικοί μηχανισμοί της οποίας δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Πρόσφατες μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν μία προστατευτικη δράση διαφόρων αντιοξειδωτικών όπως οι βιταμίνες C και Ε και φλαβονοειδών έναντι των αλλοιώσεων που προκαλεί η υπερλιπιδαιμία και το οξειδωτικό stress στη δομή του αμφιβληστροειδούς.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να μελετηθούν οι μορφολογικές και δομικές αλλοιώσεις που προκαλούνται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα εξαιτίας της υπερχοληστερολαιμίας και του οξειδωτικού stress σε πειραματόζωα και να διερευνηθεί η πιθανή προστατευτική δράση του φυτού Crocus sativus (saffron) ως διατροφικού παράγοντα στον αμφιβληστροειδή χιτώνα. Oι αντιοξειδωτικές, νευροπροστατευτικές και αντιισχαιμικές ιδιότητες του κρόκου, που έχουν καταδειχθεί από προηγούμενες μελέτες, οδηγούν στην υπόθεση ότι ο κρόκος ως διατροφικός παράγοντας ενδεχομένως δρα προστατευτικά κατά της αμφιβληστροειδοπάθειας λόγω αθηρωμάτωσης.Για την πειραματική μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια τα οποία χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες από 7 πειραματόζωα η καθεμία: H πρώτη ομάδα (control), η ομάδα ελέγχου, αποτελούνταν από ποντίκια C57bl6 και τρεφόταν με κανονική τροφή. Η δεύτερη ομάδα (apo-E) αποτελούνταν από διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη απολιποπρωτείνης Ε και τρεφόταν με τροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε χοληστερόλη. Τα διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη ApoE έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί ως πειραματικό μοντέλο για την αθηρωμάτωση. Τα ποντίκια αυτά αναπτύσσουν αυτομάτως υπερχοληστερολαιμία, υψηλά επίπεδα LDL και αθηρωματικές βλάβες παρόμοιες με αυτές που αναπτύσσονται στο αρτηριακό δίκτυο του ανθρώπου. Η τρίτη ομάδα (apo-E+C) , αποτελούνταν από ποντίκια με έλλειψη ApoE και διατροφή υψηλή σε χοληστερόλη ενώ σ’ αυτές χορηγούνταν καθημερινά υδατικό εναιώρημα κρόκου στο νερό, σε δοσολογία 25 mg/kg βάρους,. Μετά από 20 εβδομάδες τα ποντίκια θανατώθηκαν με ευθανασία και αφαιρέθηκαν οι οφθαλμικοί βολβοί, οπότε και υπέστησαν ειδική προετοιμασία για ιστολογική μελέτη. Στο τέλος του πειράματος έγινε αιμοληψία για τη μέτρηση του λιπιδαιμικού προφίλ, του οξειδωτικού stress και δεικτών φλεγμονής στο πλάσμα των πειραματοζώων. Από τις αιμοληψίες προσδιορίστηκαν: ολική χοληστερόλη ορού, τριγλυκερίδια ορού, χαμηλής πυκνότητος λιποπρωτεΐνη (LDL), ολική οξειδωτική ικανότητα (perOX), λεπτίνη και C αντιδρώσα πρωτεΐνη. Η ιστολογική ανάλυση περιλάμβανε μελέτη των ιστολογικών παρασκευασμάτων στο οπτικό μικροσκόπιο, ψηφιοποίηση των ιστολογικών εικόνων και ψηφιακή επεξεργασία για την εξαγωγή δεδομένων που αφορούσαν στο πάχος των διαφόρων στιβάδων του αμφιβληστροειδούς, καθώς και την πυκνότητα των κυττάρων της έξω κοκκώδους στιβάδας.Στη συνέχεια ακλούθησε στατιστική ανάλυση επί των αποτελεσμάτων, ώστε να διαπιστωθούν συσχετίσεις που ενισχύουν την ερευνητική υπόθεση της παρούσας εργασίας.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομάδα που ελάμβανε κρόκο Κοζάνης είχε ίδια επίπεδα σακχάρου με την ομάδα control, σε αντίθεση με την ομάδα apo-E, η οποία εμφάνιζε αυξημένα επίπεδα. Αντίστοιχα, το βάρος της ομάδας apo – E ήταν αυξημένο σε σχέση με την ομάδα control, σε αντίθεση με την ομάδα apo-E +C. Η ιστολογική μελέτη έδειξε ότι η ομάδα apo – E εμφάνιζε μικρότερη πυκνότητα κυττάρων στην έξω κοκκώδη στιβάδα, καθώς και μικρότερο πάχος στη στιβάδα γαγγλιακών κυττάρων, ενώ η ομάδα apo-E+C δεν διέφερε από την ομάδα control. Τα παραπάνω οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η χορήγηση κρόκου Κοζάνης έδρασε προστατευτικά έναντι των αλλοιώσεων που προκλήθηκαν στον αμφιβληστροειδή λόγω της υπερλιπιδαιμίας, αλλά και ελάττωσε τα επίπεδα σακχάρου και το σωματικό βάρος στα αντίστοιχα πειραματόζωα.