Προσδιορισμός του αριθμού και του τύπου των θέσεων EPIYA στην πρωτεϊνη CagA του Helicobacter pylori στον ελληνικό πληθυσμό: μελέτη της επίπτωσής τους στη λειτουργία μορίων που ελέγχουν τη δομή και τη μεταγωγή σήματος των εστιακών συνδέσμων (focal adhesions) στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα

Abstract

Helicobacter pylori is a Gram-negative pathogen that infects the human gastric mucosa and causes achronic infection affecting 50% of world population. The majority of H. pylori-infected people areasymptomatic and the infection manifests microscopically as chronic superficial pangastritis. Nevertheless,approximately 5% of the children and 10-15% of the adults infected with H. pylori develop duodenal orgastric ulcer. Furthermore, H. pylori infection increases 6-fold the risk of developing non-cardia gastricadenocarcinoma and gastric MALT (Mucosa-associated Lymphoid Tissue) lymphoma, cancer types thataffect approximately 1% of H. pylori-infected adults. The pathogenicity of H. pylori is mediated by variousfactors, among which the cytotoxins CagA (Cytotoxin-associated gene A) and VacA (Vacuolating cytotoxinA) are the best studied. CagA is being injected inside the gastric epithelial cell via a specialized type IVsecretion system (T4SS) and its virulence properties are determined by repeating tyrosine phosphorylationEPIYA motifs located within the variable carboxyl-terminal region of the protein. Western-type CagAproteins harbor three different types of EPIYA-containing regions, namely A [KKELNEKFKNFNNNNNGLKN(ST)EPIYAKVNKKK], B [(A/T/V/S)GQ(V/A)ASPEPIY(A/T)(Q/K)VAKKVNAKIDRLNQIASGLGGVGQAAG]and C [FPLKRHDKVDDLSKVG(R/L)S(V/Α)SPEPIYATIDDLGGP]. On the other hand, VacA cytotoxicity (absent,mild, high) depends on the combination (sx/ix/mx) of the specific active (s1, i1, m1) or inactive (s2, i2, m2)alleles for the three variable regions (signal, intermediate, middle) of the vacA gene.The aim of the present thesis was to map the functional CagA-EPIYA and VacA polymorphisms in 313clinical strains which were isolated from gastric biopsies of Greek symptomatic patients (98 children, 144adults with peptic ulcer and non-peptic ulcer lesions) and assess their clinical significance in the context ofH. pylori infection. Moreover, CagA tyrosine phosphorylation at the EPIYA motifs and its effect on focaladhesion dynamics were also studied. The number of EPIYA motifs was determined by a novel one-stepPCR-based method, whereas their type (A, B, C) and combination were assessed by sequencing of the 3’variable region of the cagA gene. The presence of a functional T4SS, mediating CagA translocation, wasassessed following in vitro infection of gastric epithelial cells with the clinical H. pylori strains through (a)the expression and phosphorylation of CagA, (b) the induction of hummingbird phenotype and (c) thesecretion of IL-8. The distribution of the various polymorphisms was studied in relation to (a) the age ofthe patients in the antrum, and (b) the colonization of distinct regions within the stomach (antrum,corpus), specifically for adults. The possible associations with the clinicopathological parameters of H.pylori-induced chronic active gastritis and related gastric disease were assessed by logistic regressionanalysis. The kinetics of CagA tyrosine phosphorylation at the EPIYA sites were studied following in vitroinfection of gastric epithelial cells with isogenic H. pylori strains with different number of EPIYA-C motifsand their effect on regulatory and scaffolding proteins of the focal adhesion protein complex (FAK, PYK2,Paxillin, CRK, p130Cas, c-Src, SHP2).The prevalent infection in the antrum of children comprised H. pylori strains lacking a functional T4SS andcytotoxic VacA. The antrum mucosa in the majority of adults was colonized primarily by strains withfunctional T4SS and 3 EPIYA sites in the ABC combination. In addition, the frequencies of vacA i1 strainswere significantly elevated compared to infections from children. The prevalent type of strains withfunctional T4SS irrespective of the patient’s age harbored 3 EPIYA sites (ABC), followed by strains with 4 EPIYA sites (ABCC). Although no significant differences were observed between children and adults withregards to the number of CagA-EPIYA repeats, strains with more than 4 EPIYA motifs (ABCCC, ABCCCC),which were detected in very low frequencies (approximately 3%), were isolated exclusively from adults. Atrend towards increasing number of EPIYA motifs was observed in the corpus mucosa compared to theantrum in adult patients, possibly reflecting an evolutionary modification of CagA in the context ofchronic infection, due to the clonal relation of the paired antral-corporal strains according to MLST.In the pediatric population, no significant association was observed between EPIYA or VacApolymorphisms and the clinicopathological parameters of H. pylori-induced gastritis. Among adults, thepresence of the vacA i1 allele and high H. pylori colonization at the antrum mucosa were characterized asindependent risk factors for the development of severe gastritis, regarding both the chronic activity andthe inflammatory infiltration. Furthermore, infection with strains carrying 3 EPIYA motifs (ABC) was anindependent risk factor for the development of peptic ulcer disease. The presence of more than 3 EPIYAsites did not modify further the observed risk. These particular associations possibly indicate theinvolvement of VacA with the inflammatory process, whereas CagA is probably implicated in thedevelopment of distinct disease phenotypes.In accordance, the number of CagA-EPIYA motifs, as well as the presence of CagA per se, did not affect the levels of secreted IL-8 upon in vitro infection of gastric epithelial cells with pairs of isogenic H. pyloriclinical strains with different number of EPIYA-C sites. IL-8 secretion was solely dependent on thepresence of functional T4SS in the infecting strain, given the fact that infection with the correspondingCagA-KO mutants, that lack a functional cagA gene but maintain T4SS functionality, induced the samelevels of IL-8 with the wild-type strains. Utilizing the same in vitro infection system, CagA proteins withhigher number of EPIYA-C motifs within each isogenic pair presented increased rate and levels of tyrosinephosphorylation compared to the strain harboring less EPIYA sites. Despite that, considerable differenceswere observed regarding the levels of tyrosine phosphorylation among different isogenic pairs, whichwere probably attributed, at least in part, to specific nucleotide substitutions observed within the EPIYA-Bsites, and determined the extent of cytoskeletal alterations of infected epithelial cells.These strain- and EPIYA-dependent differences regarding CagA phosphorylation were reflected in thevariable effect of different CagA proteins on the activation levels and cellular localization of focal adhesionkinases FAK and PYK2. In the case of FAK, a transient EPIYA-C-dependent reduction in the levels oftyrosine 397 phosphorylation levels was observed early during infection, irrespective of strain. Totaltyrosine phosphorylation levels of FAK were also reduced, in a strain- and EPIYA-dependent manner,whereas an as an EPIYA-C-dependent reduction in the expression levels of the adaptor protein Paxillinwas evident early during infection, indicating a perturbation of FAK activation and signaling pathways anda transient focal adhesion turnover. On the contrary, along with FAK deactivation, a simultaneousinduction of FAK-related kinase PYK2 tyrosine phosphorylation was detected, a finding that is reported for the first time as far as H. pylori infection is concerned. PYK2 tyrosine phosphorylation took place in anEPIYA-C-dependent manner, irrespective of the H. pylori strain, although an increase was also observedlater during infection with strains lacking CagA, indicating the participation of other unidentified H. pylorifactors in the process of PYK2 activation. Despite that, the involvement of CagA and EPIYA motifs role was verified by the physical interaction between CagA and PYK2 that was observed as an early event and wasmainly dependent on the presence of EPIYA-C motifs in CagA, as well as the subsequent translocation ofPYK2 to the cell nucleus. Taking into account the engagement of nuclear FAK and PYK2 in theubiquitination and proteasomal degradation of p53 tumor suppressor, the nuclear translocation of PYK2,but also FAK, during H. pylor infection may reflect a CagA-driven transduction of survival signals from thecell periphery, where the bacteria attach, to the nucleus as a compensatory effect on the apoptotic andvacuolating action of VacA protein.In conclusion, CagA and VacA polymorphisms play a significant role during adulthood in the clinicaloutcome of H. pylori infection and the severity of the underlying inflammation respectively. On the otherhand, their effect during early infection stages as observed in childhood is not substantiated, probablydue to the absence of accumulated lesions and the milder virulent features of the bacterium, thatgradually evolve during the chronic infection. Accordingly, the manifestation of CagA pathogenicity,dependent on the variability of the EPIYA-containing regions, seems to require the participation of otherH. pylori strain-dependent phenotypic traits, which emanate under the pressure of the crosstalk of thepathogen with its particular host. This ongoing variability reflects the multifactorial nature of theinteractions that drive the long-term progression of the infection and necessitates the study of differentclinical strains outside their original human hosts in order to identify the particular characteristics of the pathogen and the host that determine its outcome.

Το Helicobacter pylori είναι ένα Gram-αρνητικό παθογόνο το οποίο προσβάλει το γαστρικό βλεννογόνοτου ανθρώπου και προκαλεί χρόνια λοίμωξη με επιπολασμό που αγγίζει το 50% παγκοσμίως. Στηνπλειοψηφία των φορέων η λοίμωξη εκδηλώνεται ως χρόνια πανγαστρίτιδα, η οποία παραμένεισυνήθως ασυμπτωματική. Παρόλα αυτά, στο 5% των παιδιών και το 10-15% των ενηλίκωναναπτύσσεται δωδεκαδακτυλικό ή γαστρικό έλκος. Επιπλέον, παρουσία λοίμωξης αυξάνεται 6 φορές οκίνδυνος ανάπτυξης αδενοκαρκινώματος του στομάχου μη καρδιακού τύπου και γαστρικού MALT(Mucosa-associated Lymphoid Tissue) λεμφώματος, κακοήθεις νεοπλασίες που παρατηρούνται στο 1%περίπου των ενηλίκων. Η παθογένεια του H. pylori εκδηλώνεται μέσω διαφόρων παραγόντων, εκ τωνοποίων το κύριο ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται στις κυτταροτοξίνες CagA (Cytotoxin-associatedgene A) και VacA (Vacuolating cytotoxin A). H CagA ενίεται στο γαστρικό επιθηλιακό κύτταρο μέσωεξειδικευμένου συστήματος μεταφοράς τύπου IV (Τ4SS) και η παθογένειά της καθορίζεται απόεπαναλαμβανόμενες περιοχές στο καρβοξυτελικό άκρο της που περιέχουν θέσεις φωσφορυλίωσηςτυροσίνης της μορφής EPIYA. Οι θέσεις EPIYA σε στελέχη από Δυτικούς πληθυσμούς είναι της μορφής A[KKELNEKFKNFNNNNNGLKN(ST)EPIYAKVNKKK], B [(A/T/V/S)GQ(V/A)ASPEPIY(A/T)(Q/K)VAKKVNAKIDRLNQIASGLGGVGQAAG] και C [FPLKRHDKVDDLSKVG(R/L)S(V/Α)SPEPIYATIDDLGGP]. Ο βαθμόςκυτταροτοξικότητας της VacA (απουσία, ήπιος, υψηλός) καθορίζεται από το συνδυασμό (sx/ix/mx) τωνενεργών (s1, i1, m1) και ανενεργών (s2, i2, m2) αλληλίων των τριών μεταβλητών περιοχών τουγονιδίου vacA (signal, intermediate και middle).Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η χαρτογράφηση των λειτουργικών πολυμορφισμών EPIYA τηςπρωτεΐνης CagA και των επιπέδων κυτταροτοξικότητας της VacA σε 313 κλινικά στελέχη H. pylori πουαπομονώθηκαν από Έλληνες ασθενείς (98 συμπτωματικά παιδιά, 144 ενήλικες με πεπτικό έλκος και μηελκωτικές αλλοιώσεις) και η εκτίμηση της κλινικής σημασίας τους. Μελετήθηκε επίσης ηφωσφορυλίωση της CagA στις θέσεις EPIYA και η επίδρασή της στη δομή και λειτουργικότητα τωνεστιακών συνδέσμων. Ο αριθμός των θέσεων EPIYA στην CagA εκτιμήθηκε μέσω νέας μεθόδου πουαναπτύχθηκε για τις ανάγκες της μελέτης, ενώ ο ακριβής τύπος και συνδυασμός τους προσδιορίστηκεμε ανάγνωση αλληλουχίας της 3’ μεταβλητής περιοχής του γονιδίου cagA. Η λειτουργικότητα του T4SSτων κλινικών στελεχών H. pylori προσδιορίστηκε μετά από in vitro επιμόλυνση γαστρικών επιθηλιακώνκυττάρων και μελέτη (α) της έκφρασης και φωσφορυλίωσης της CagA, (β) των επαγομένωνφαινοτυπικών αλλαγών στα προσβεβλημένα κύτταρα και (γ) της έκκρισης IL-8 από αυτά. Η κατανομήσυχνοτήτων των διαφορετικών πολυμορφισμών μελετήθηκε αναφορικά (α) με την ηλικία τωνασθενών στο άντρο του στομάχου και (β) τη θέση του στομάχου (άντρο, σώμα) ειδικά για τουςενήλικες. Η διερεύνηση των πιθανών συσχετίσεων με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και τηνκλινική εκδήλωση της Ελικοβακτηριδιακής γαστρίτιδας πραγματοποιήθηκε με ανάλυση λογιστικήςπαλινδρόμησης. Η κινητική της φωσφορυλίωσης της CagA στις θέσεις EPIYA και η επίδρασή της σερυθμιστικές και δομικές πρωτεΐνες των εστιακών συνδέσμων (FAK, PYK2, Paxillin, CRK, p130Cas, c-Src,SHP2) μελετήθηκε μετά από in vitro επιμόλυνση γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων με ισογονιδιακά στελέχη H. pylori με διαφορετικό αριθμό θέσεων EPIYA-C. Στο άντρο των παιδιών επικράτησαν στελέχη με μη λειτουργικό T4SS και μη κυτταροτοξική πρωτεΐνηVacA. Στα ενήλικα άτομα παρατηρήθηκαν ως επί το πλείστον απλές λοιμώξεις από στελέχη μελειτουργικό T4SS και 3 θέσεις EPIYA τύπου ABC, ενώ παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των στελεχώνπου έφεραν το ενεργό αλλήλιο vacA i1 και τάση αύξησης των κυτταροτοξικών τύπων της VacAσυγκριτικά με τα παιδιά. Και στις δύο ομάδες, η πλειοψηφία των στελεχών με λειτουργικό Τ4SS έφερε 3θέσεις τύπου ABC, ενώ τα επόμενα σε συχνότητες στελέχη έφεραν 4 θέσεις τύπου ABCC. Αν και δεδιαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στον αριθμό των θέσεων EPIYA στο πυλωρικό άντροπαιδιών και ενηλίκων, στελέχη με περισσότερες των 4 θέσεων EPIYA, τα οποία παρατηρήθηκαν σειδιαίτερα χαμηλές συχνότητες (περίπου 3%), απομονώθηκαν αποκλειστικά από ενήλικα άτομα. Τάσηαύξησης του αριθμού των θέσεων EPIYA-C παρατηρήθηκε επίσης στο σώμα συγκριτικά με το άντροτου στομάχου σε ενήλικες, υποδηλώνοντας εξελικτική τροποποίηση της CagA στο έδαφος της χρόνιαςλοίμωξης, δεδομένης της κλωνικής σχέσης των στελεχών άντρου-σώματος βάσει ανάλυσης με MLST.Εκτός των κλωνικών στελεχών άντρου-σώματος, στο σύνολο του δείγματος απομονώθηκαν 28περιπτώσεις μικτών λοιμώξεων από ισογονιδιακά στελέχη στο ίδιο βιοπτικό υλικό, τα οποία διέφερανμόνο ως προς τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C στην CagA, παρά το γεγονός ότι η υπόλοιπηαλληλουχία του γονιδίου cagA ήταν ταυτόσημη.Στα παιδιά δεν παρατηρήθηκε ουδεμία συσχέτιση με τα κλινικοπαθολογικά ευρήματα της ελικοβακτηριδιακής γαστρίτιδας. Στους ενήλικες, η παρουσία του αλληλίου vacA i1 και υψηλούβακτηριακού φορτίου στο άντρο του στομάχου χαρακτηρίστηκαν ως οι μόνοι ανεξάρτητοιπαράγοντες κινδύνου ανάπτυξης βαρύτερης γαστρίτιδας, όσον αφορά στην ενεργό δραστηριότητα καιστη χρόνια φλεγμονή. Επιπλέον, η παρουσία 3 θέσεων EPIYA (ABC) διαπιστώθηκε να αυξάνει τονκίνδυνο ανάπτυξης έλκους, ενώ η παρουσία τεσσάρων θέσεων EPIYA (ABCC) δεν διαφοροποίησεπεραιτέρω τον παρατηρούμενο κίνδυνο. Οι συγκεκριμένες συσχετίσεις πιθανόν καταδεικνύουνσυμμετοχή της VacA στη φλεγμονώδη απόκριση, ενώ η CagA φαίνεται να επηρεάζει τη δημιουργίασυγκεκριμένων κλινικών οντοτήτων.Αντίστοιχα, η παρουσία περισσοτέρων θέσεων EPIYA στην CagA, καθώς και η CagA per se, δενδιαφοροποίησαν σημαντικά τα επίπεδα εκκρινόμενης IL-8 από γαστρικά επιθηλιακά κύτταραεπιμολυσμένα in vitro με ζεύγη ισογονιδιακών κλινικών στελεχών με διαφορετικό αριθμό θέσεωνEPIYA-C. Η έκκριση IL-8 διαπιστώθηκε να εξαρτάται αποκλειστικά από την παρουσία λειτουργικούT4SS στο εκάστοτε στέλεχος H. pylori, δεδομένου ότι παρατηρήθηκε επαγωγή της από CagA-Knock οutμεταλλάγματα, στα οποία προκλήθηκε σίγηση του γονιδίου cagA μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού,χωρίς να διαταραχθεί το T4SS. Στο ίδιο in vitro σύστημα, διαπιστώθηκε ότι οι πρωτεΐνες CagA με τιςπερισσότερες θέσεις EPIYA σε όλα τα ζεύγη στελεχών εμφάνιζαν υψηλότερο ρυθμό και επίπεδαφωσφορυλίωσης σε κατάλοιπα τυροσίνης. Παρόλα αυτά παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σταεπίπεδα φωσφορυλίωσης της CagA μεταξύ ζευγών στελεχών, εξαρτώμενες πιθανόν από επιμέρουςαντικαταστάσεις στη νουκλεοτιδική αλληλουχία των θέσεων EPIYA-B κυρίως, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την έκταση των μορφολογικών αλλοιώσεων στα προσβεβλημένα κύτταρα.Οι εξαρτώμενες από το στέλεχος και τις θέσεις EPIYA διαφορές αυτές, αντικατοπτρίστηκαν επίσης στηνεπίδραση της CagA και των θέσεων EPIYA στη λειτουργικότητα των κινασών των εστιακών συνδέσμων FAK και PYK2. Όσον αφορά στην FAK, διαπιστώθηκε αποφωσφορυλίωσή της στη θέσηενεργοποίησης Υ397 στα πρώιμα στάδια της επιμόλυνσης των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων,κατά τρόπο εξαρτώμενο από τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C. Εκτός αυτού, παρατηρήθηκε πτώσητων συνολικών επιπέδων φωσφορυλιωμένης σε κατάλοιπα τυροσίνης FAK, ειδικά παρουσία τουζεύγους στελεχών H. pylori που προκάλεσε τις πιο χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλοιώσεις σταγαστρικά επιθηλιακά κύτταρα και κατά τρόπο εξαρτώμενο του αριθμού των θέσεων EPIYA-C.Διαπιστώθηκε επίσης πτώση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης προσαρμογέα Paxillin στα αρχικάστάδια της επιμόλυνσης, εξαρτώμενη από τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C, η οποία σε συνδυασμό μετην απενεργοποίηση της FAK υποδηλώνει παροδική αποικοδόμηση των εστιακών συνδέσμων. Εναντιθέσει, ταυτόχρονα με την απενεργοποίηση της κινάσης FAK διαπιστώθηκε επαγωγή τηςφωσφορυλίωσης της συγγενούς της FAK κινάσης PYK2, παρατήρηση η οποία πραγματοποιείται γιαπρώτη φορά στην ελικοβακτηριδιακή λοίμωξη. Η ενεργοποίηση της PYK2 ήταν ανεξάρτητη τουστελέχους και εν μέρει εξαρτώμενη των θέσεων EPIYA-C, καθώς παρατηρήθηκε σε μεταγενέστεραστάδια υπό την επίδραση στελεχών απουσία CagA (CagA-KO), υποδηλώνοντας τη συμμετοχή καιάλλων βακτηριακών παραγόντων στη διαδικασία ενεργοποίησης της PYK2. Παρόλα αυτά η εμπλοκήτης CagA και των θέσεων EPIYA επιβεβαιώθηκε μέσω της φυσικής αλληλεπίδρασης τη PYK2 με τηνCagA στα αρχικά στάδια της επιμόλυνσης κατά τρόπο εξαρτώμενο από τις θέσεις EPIYA-C κυρίως καιτην επακόλουθη μεταφορά της PYK2 στον πυρήνα του κυττάρου. Η μετατόπιση της PYK2, καθώς καιτης FAK, στον πυρήνα του κυττάρου αντικατοπτρίζει πιθανόν τη μεταφορά αντιαποπτωτικώνσημάτων υπό την επίδραση της CagA από την προσβεβλημένη περιφέρεια στον πυρήνα, όπου έχειδιαπιστωθεί ότι οι δύο κινάσες μετέχουν στην ουβικιτινίωση και πρωτεολυτική αποικοδόμηση τηςογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53, ως αναδραστικό μηχανισμό στην αποπτωτική και κυτταροτοξική δράση της VacA.Συμπερασματικά, οι πολυμορφισμοί των κυτταροτοξινών CagA και VacA φαίνεται να διαδραματίζουνσημαντικό ρόλο κατά την ενήλικη ζωή στην κλινική εκδήλωση της ελικοβακτηριδιακής λοίμωξης και τηβαρύτητα της αναπτυσσόμενης φλεγμονής αντίστοιχα. Εν αντιθέσει στα παιδιά η επίπτωσή τους δενείναι ξεκάθαρη, πιθανόν λόγω της απουσίας συσσωρευμένων αλλοιώσεων και των ηπιότερωνπαθογενετικών χαρακτήρων που εμφανίζει το βακτήριο, οι οποίοι μετεξελίσσονται στο έδαφος τηςχρόνιας λοίμωξης. Αντίστοιχα, η εκδήλωση της παθογένειας της CagA μέσω των θέσεων EPIYAπροϋποθέτει σε ένα βαθμό τη συμβολή και άλλων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του στελέχους, ταοποία πιθανόν διαμορφώνονται υπό την πίεση της αλληλεπίδρασης του βακτηρίου με τον εκάστοτεξενιστή. Η ποικιλομορφία αυτή αντικατοπτρίζει την πολυπαραγοντική φύση των αλληλεπιδράσεωνπου αναπτύσσονται στη μακροχρόνια εξέλιξη της ελικοβακτηριδιακής λοίμωξης και την ανάγκημελέτης της συμπεριφοράς διαφορετικών κλινικών στελεχών ex vivo για το χαρακτηρισμό τωνπαραγόντων εκείνων του ξενιστή και του παθογόνου που καθορίζουν την έκβασή της.