Φασματοφωτομετρικός μικροπροσδιορισμός σιδήρου και κοβαλτίου με κυανέρυθρη ν-οξίνη αλιζαρίνη σε φυτικά και ζωικά δείγματα

Abstract

Iron is the sixth most abundant element in the world and accounts for about 5% ofthe earth's crust, contrary to cobalt which is only 0.0029%.Iron is in the 4th period and the 8th group of the periodic table, with 26 atomicnumber and 55.847 atomic mass. The usual oxidation numbers are +2 and +3. It is agray-white or grayish metal sufficiently malleable and ductile, softer than aluminum thatcan obtain any desirable shape, however it is very sensitive to the presence of oxygenand water. The boiling point of pure iron is 2,862 °C and the melting point 1,538 °C. Themajor mineral metals of iron are, Magnetite, Hematite, Limonite, Siderite and Chamositis.Combining these features with the low cost, steel and various alloys of iron, is now widelyused in modern industry.In addition, iron is the most abundant transition metal and has the most biologicalroles of any other element. Fe2+ is an essential trace element used by almost all the livingorganisms, while Fe3+ is well absorbed. In the human body, iron is transferred in the bloodby the transferrin and stored in the liver, spleen and bone marrow. Furthermore, iron is noteasily excreted from the human body, so it can be accumulated to toxic concentrations,which can even cause death.Cobalt is in the 4th period and the 9th group of the periodic table, with 27 atomicnumber and 58.933 atomic mass. The usual oxidation numbers are +2 and +3. The boilingpoint of pure cobalt is 2,927 °C and the melting point 1,495 °C. Apart from nickel and iron,cobalt is one of the three naturally magnetic elements. The major mineral metals of cobaltare, Kovaltitis, Sfairokovalitis, Erythritis, Soffloritis and Skoutterouditis.Previously, compounds of cobalt had used in dying, giving blue color to the glass,in enamels, in ceramics and painting. Nowadays, cobalt isotopes, as 57Co, are used inmedicine, with the testing control-Schilling, in research as a source at the Mössbauerspectroscopy and also in fluorescent X-rays devices, while the isotope 60Co, a radioactivemetal, which its half-life is 5.27 years, is used in radiotherapy. Finally the isotope 59Co,can be used in the manufacture of a weapon, known as "cobalt bomb".Cobalt is an essential dietary trace element for all animals. It is the active center ofcoenzymes called cobalamins and the most famous example of these is vitamin B12. Vitamin B12 is essential for the proper functioning of cells, keeps the nervous systemhealthy, increases the body energy and reduces the irritability. It also improvesconcentration, memory and balance. Vitamin B12 is essential during the rapid separation of cells, is useful for the folic acid release and thus helps to helps in red blood cell formation. Finally, vitamin B12 is found almost exclusively in animal’s flesh and animal products.In case of iron and cobalt deficiency, there are replenishment formulations to refillthe Recommended Daily Allowance (RDA) limits. Deficiency in iron and cobalt mainlyleads to anemia with the known symptoms like exhaustion, weakness etc. In addition, deficiency in cobalt-vitamin B12 leads to neurological problems and it is difficult to bedetermined directly, because of the high levels of accumulation.For these reasons, the determination of the iron and cobalt percentage in drinkingwater, food, pharmaceutical products and biological samples, is necessary to avoidaccumulation of these metals while has attracted great interest, using many differenttechniques of instrumental analysis as GFAAS, SPS, HPLC, ICP, V, P, F and UV / Vis,which was used in our laboratory.In this direction, the choice of Acid Alizarin Violet N (AAVN-AVN) and 1,10phenanthroline as possible coupling reagents, gave a very strong reaction with iron andcobalt. The parameters studied for method optimization were, the ligant concentration, pH,time and the reaction temperature and the affinity between the metal and the ligand.The optimum pH value for the reaction of iron and cobalt with ligands was studied ina pH range between 3.4 and 5.9, whereas pH 5.0 was the optimal value. Α buffer solutionof acetic acid 0.2 M and sodium acetate 0.2 M was used for this purpose in order to avoidundesirable deviations of the measurements. Ιt was found that the complexation betweenligands and metal ions, at room temperature, was not complete, so a water bath at 60 °Cfor 30 minutes was needed. Stock and working solutions were prepared either in distilledwater or in 0.1 M HNO3 and was always fresh. However, repeated measurements ofabsorption standards AVN, demonstrated that they were stable for 10 to 13 days.The optimum AVN concentration, for concentration range of iron, 1 to 5 μΜ, wasfound to be from 30 μΜ to 90 μΜ. The experimental concentration of AVN chosen was 50μΜ. For complexes AVN-Fe3+, 1,10 phenanthroline-H3NOCl-Fe2+ and AVN-Co2+, theminimum-maximum limits of determination of Fe3+, Fe2+ and Co2+ are: 0.2 to 36 μM, 0.2 to24 μM and 0.2 to 160 μM. However, for complexes AVN-Fe3+ and AVN-Co2+ showed theexistence of six complexes between metal ion (M) and ligand (L), as follows: ML, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6. Various metal ions, found in several samples, preventing the determination of ironand cobalt giving errors which are due to the absorption of the matrix (matrix effect). Forthis reason, it was chosen to use the selected Ιsosbestic Point (IS) of the complex AVN-Al3+, in order to remove the obstruction of ions Al3+ and AlPO4. Applying the Beer law formixtures, the interference effect of these ions are decreased to a satisfactory extent.By using the calibration curve of known addition method and applying the method ofleast squares, the variations in absorption in relation to the concentration of iron andcobalt applied to the determination of these metal ions in the reference samples as PrawnGBW08572, the Wheat NCS ZC73009 and LP-Prawn (reference sample which wasprepared in the laboratory). The limit of detection (LOD) and quantification limit (LOQ) forFe3+ in standard samples examined is 0.97×10-8 and 2.91×10-8 M, for Fe2+ is 5.36×10-8and 1.62×10-7 M and for Co2+ is 0.3×10-7 and 0.9×10-7 M respectively. The LOD and LOQof the methods, calculated from the standard deviation of all points of the curve.In conclusion, with this proposed method, the theoretical and actual detection limit isnow about 2, 3 times lower. So, the prevailing hitherto perception about the errorabsorption spectrophotometry should be revised, since proved that the relative error isgreater in smaller concentrations or in greater transmittance. Namely, it can be developedaccurate and sensitive spectrophotometric methods, measuring at the top of the scale ofthe transmittance (T = 99%).

Ο σίδηρος είναι το έκτο αφθονότερο στοιχείο στον κόσμο, ενώ αποτελεί περίπουτο 5% του φλοιού της γης, σε αντίθεση με το κοβάλτιο το οποίο αποτελεί μόλις το0,0029%.Ο σίδηρος βρίσκεται στην 4η περίοδο και την 8η ομάδα του περιοδικού πίνακα, μεατομικό αριθμό 26 και ατομική μάζα 55,847. Οι συνήθεις αριθμοί οξείδωσης είναι +2 και+3. Είναι αργυρόλευκο ή γκριζωπό μέταλλο, αρκετά όλκιμο και ελατό, μαλακότερο και απότο αλουμίνιο και μπορεί να αποκτήσει οποιοδήποτε επιθυμητό σχήμα, ωστόσο είναι πολύευαίσθητος στην παρουσία οξυγόνου και νερού. Το σημείο ζέσεως του καθαρού σιδήρουείναι 2.862 οC και το σημείο τήξης του είναι 1.538 οC. Τα σημαντικότερα ορυκτάμεταλλεύματα του σιδήρου είναι, ο Μαγνητίτης, ο Αιματίτης, ο Λειμωνίτης, ο Σιδηρίτης καιο Χαμοσίτης. Συνδυάζοντας τα παραπάνω χαρακτηριστικά με το χαμηλό κόστος, χάλυβεςκαι διάφορα κράματα σιδήρου, χρησιμοποιούνται πλέον ευρύτερα στη σύγχρονηβιομηχανία.Ο σίδηρος είναι το πιο άφθονο στοιχείο μετάπτωσης και έχει τους περισσότερουςβιολογικούς ρόλους από κάθε άλλο στοιχείο. Ο Fe2+ είναι ένα απαραίτητο ιχνοστοιχείοπου χρησιμοποιείται από σχεδόν όλους τους οργανισμούς διαβίωσης, ενώ ο Fe3+ είναιπερισσότερο ευαπορρόφητος. Στον ανθρώπινο οργανισμό ο σίδηρος μεταφέρεται στοαίμα, από την πρωτεΐνη τρανσφερίνη και αποθηκεύεται στο ήπαρ, στον σπλήνα και στονμυελό των οστών. Δεν αποβάλλεται εύκολα από το ανθρώπινο σώμα, γι’ αυτό ο σίδηροςμπορεί να αθροιστεί και να εμφανιστούν τοξικές συγκεντρώσεις, οι οποίες μπορούν ναπροκαλέσουν ακόμα και τον θάνατο.Το κοβάλτιο βρίσκεται στην 4η περίοδο και την 9η ομάδα του περιοδικού πίνακα μεατομικό αριθμό 27 και ατομική μάζα 58,933. Οι συνήθεις αριθμοί οξείδωσης είναι +2 και+3. Το σημείο ζέσεως του καθαρού κοβαλτίου είναι 2.927 οC και το σημείο τήξης του είναιστους 1.495 οC. Εκτός από το νικέλιο και τον σίδηρο, το κοβάλτιο είναι ένα από τα τρίαφυσικά μαγνητικά στοιχεία. Τα κυριότερα ορυκτά μεταλλεύματα του κοβαλτίου είναι οΚοβαλτίτης, ο Σφαιροκοβαλίτης, ο Ερυθρίτης, ο Σοφφλορίτης και ο Σκουττερουδίτης.Παλιότερα, οι ενώσεις του κοβαλτίου έχουν χρησιμοποιηθεί ως ένα είδος βαφής,προσδίδοντας μπλε χρώμα στο γυαλί, στα σμάλτα, στα κεραμικά και τη ζωγραφική. Στησημερινή εποχή χρησιμοποιούνται στην ιατρική τα ισότοπα κοβαλτίου 57Co, με τις δοκιμές- ελέγχου Schilling, στην έρευνα ως πηγή στη φασματοσκοπία Mössbauer και στιςσυσκευές φθορισμού με ακτίνες-Χ, ενώ το ισότοπο 60Co, το οποίο έχει ημιζωή 5,27 χρόνια και είναι ένα ραδιενεργό μέταλλο, χρησιμοποιείται στην ακτινοθεραπεία. Τέλος το ισότοπο59Co, μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην κατασκευή ενός όπλου, γνωστού ως «βόμβαΚοβαλτίου».Το Κοβάλτιο, είναι βασικό διαιτητικό ιχνοστοιχείο για όλα τα ζώα. Είναι το ενεργόκέντρο των συνενζύμων που ονομάζονται κοβαλαμίνες, με το πιο γνωστό παράδειγμααυτών να είναι η βιταμίνη Β12. Η βιταμίνη B12 μας είναι απαραίτητη για την καλή λειτουργίατων κυττάρων, διατηρεί υγιές το νευρικό σύστημα, ενώ αυξάνει την ενεργητικότητα καιμειώνει την ευερεθιστότητα. Επίσης, βελτιώνει την αυτοσυγκέντρωση, τη μνήμη και τηνισορροπία. Η βιταμίνη B12 είναι σημαντική κατά τον ταχύ χωρισμό των κυττάρων, είναιχρήσιμη για την απελευθέρωση του φολικού οξέος και έτσι βοηθάει στη δημιουργίαερυθρών αιμοσφαιρίων. Τέλος η βιταμίνη B12 βρίσκεται σχεδόν αποκλειστικά στη σάρκατων ζώων καθώς και στα ζωικά προϊόντα.Σε περίπτωση έλλειψης σιδήρου και κοβαλτίου, υπάρχουν σκευάσματααναπλήρωσης για να πληρωθούν τα Συνιστώμενα όρια Ημερήσιας Πρόσληψης (ΣΗΠ).Ανεπάρκεια σε σίδηρο και κοβάλτιο οδηγεί κυρίως σε αναιμία, με τα γνωστά συμπτώματάτης όπως εξουθένωση, αδυναμία κ.α.. Επιπρόσθετα, η ανεπάρκεια κοβαλτίου-βιταμίνηςΒ12 οδηγεί σε νευρολογικά προβλήματα και είναι δύσκολο να διαπιστωθεί άμεσα, εξαιτίαςτων υψηλών επιπέδων συσσώρευσης.Για τους παραπάνω λόγους, ο προσδιορισμός του ποσοστού του σιδήρου και τουκοβαλτίου στο πόσιμο νερό, στα τρόφιμα, σε φαρμακευτικά προϊόντα και σε βιολογικάδείγματα, είναι απαραίτητος για αποφυγή την συσσώρευσης των μετάλλων αυτών ενώέχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον, χρησιμοποιώντας πλήθος τεχνικών ενόργανηςανάλυσης, όπως GFAAS, SPS, HPLC, ICP, VOL, POL, F και UV/Vis, η οποία καιχρησιμοποιήθηκε στο εργαστήριο μας.Στην κατεύθυνση αυτή, η επιλογή της κυανέρυθρης Ν-όξινης αλιζαρίνης (AAVN- AVN) και της 1,10 Φαινανθρολίνης ως πιθανά αντιδραστήρια σύζευξης, έδωσαν πολύισχυρή αντίδραση με τον σίδηρο και το κοβάλτιο. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν γιαβελτιστοποίηση της μεθόδου ήταν η συγκέντρωση των υποκαταστατών, το pH, ο χρόνοςκαι η θερμοκρασία της αντίδρασης και η σχετική χημική συγγένεια μεταξύ των μετάλλωνκαι του υποκατάστατη.Η βέλτιστη τιμή pH για την αντίδραση του σιδήρου και του κοβαλτίου με τουςυποκαταστάτες που μελετήθηκαν σε ένα εύρος pH μεταξύ 3,4 και 5,9, ήταν η τιμή 5,0.Ένα ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέως 0,2 M και οξικού νατρίου 0,2 M χρησιμοποιήθηκεγια αυτό το σκοπό ώστε να αποφευχθούν ανεπιθύμητες αποκλίσεις των μετρήσεων. Σεθερμοκρασία δωματίου διαπιστώθηκε ότι η συμπλοκοποίηση μεταξύ των υποκαταστατώνκαι των μεταλλοϊόντων δεν ήταν πλήρης και η χρήση υδρόλουτρου στους 60 οC για 30λεπτά ήταν αναγκαία. Διαλύματα παρακαταθήκης και εργασίας παρασκευάστηκαν είτε σεαπεσταγμένο νερό είτε σε ΗΝΟ3 0,1 Μ και ήταν πάντα φρέσκα. Ωστόσο,επαναλαμβανόμενες μετρήσεις απορρόφησης προτύπων AVN, έδειξαν ότι ήταν σταθερέςγια 10-13 μέρες.Η βέλτιστη συγκέντρωση AVN για εύρος συγκεντρώσεων σιδήρου, 1 έως 5 μΜ,βρέθηκε να είναι από 30 μΜ έως 90 μΜ. Η κύρια συγκέντρωση AVN που επιλέχτηκε γιατα πειράματα ήταν τα 50 μΜ. Για τα σύμπλοκα AVN-Fe3+, 1,10 Φαινανθρολίνη-H3NOCl- Fe2+ και AVN-Co2+, τα ελάχιστα-μέγιστα όρια προσδιορισμού των Fe3+, Fe2+ και Co2+ είναι:0,2-36 μΜ, 0,2-24 μΜ και 0,2-160 μΜ. Ωστόσο, για τα σύμπλοκα AVN-Fe3+ και AVN-Co2+αποδείχθηκε η ύπαρξη έξι συμπλόκων μεταξύ μετάλλου (Μ) και υποκαταστάτη (L) όπωςτα ακόλουθα: ML, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6. Διάφορα ιόντα που βρίσκονται σε αρκετά δείγματα, παρεμποδίζουν τονπροσδιορισμό του σιδήρου και του κοβαλτίου προσδίδοντας σφάλματα τα οποίαοφείλονται κυρίως στην απορρόφηση του μητρικού δείγματος. Για το λόγο αυτόεπιλέχθηκε η χρήση του Ισοσβεστικού Σημείου (Ι.Σ.) του συμπλόκου AVN-Al3+, με σκοπότην άρση της παρεμπόδισης από ιόντα Al3+ και AlPO4. Εφαρμόζοντας τον νόμο Beer γιαμείγματα ουσιών, το παρεμποδιστικό αποτέλεσμα των ιόντων αυτών μειώθηκε σεικανοποιητικό βαθμό.Με την χρήση καμπύλης βαθμονόμησης της μεθόδου γνωστής προσθήκης καιεφαρμογής της μεθόδου των ελάχιστων τετραγώνων, οι διακυμάνσεις απορρόφησης -σεσχέση με τη συγκέντρωση του σιδήρου και του κοβαλτίου- εφαρμόστηκαν στονπροσδιορισμό αυτών των μεταλλοϊόντων σε δείγματα αναφοράς όπως το PrawnGBW08572, το Wheat NCS ZC73009 και το LP-Prawn (δείγμα αναφοράς το οποίοπαρασκευάστηκε στο εργαστήριο). Το όριο ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ)για τον Fe3+ στα δείγματα αναφοράς που εξετάστηκαν είναι 0,97×10-8 και 2,91×10-8 M, γιατον Fe2+, είναι 5,36×10-8 και 1,62×10-7 M αντίστοιχα και για το Co2+ είναι 0,3×10-7 και0,9×10-7 M αντίστοιχα. Tα LOD και LOQ των μεθόδων, υπολογιστήκαν από την τυπικήαπόκλιση όλων των σημείων της καμπύλης αναφοράς.Ολοκληρώνοντας, με αυτή τη προτεινόμενη μέθοδο το θεωρητικό και πραγματικόόριο ανίχνευσης είναι πλέον περίπου 2, 3 φορές χαμηλότερο. Έτσι η κρατούσα μέχρισήμερα αντίληψη γύρω από το σφάλμα στη φασματοφωτομετρία απορρόφησης πρέπεινα αναθεωρηθεί, αφού αποδείχτηκε ότι το σχετικό σφάλμα είναι μεγαλύτερο στις μικρότερες μόνο συγκεντρώσεις ή στη μεγαλύτερη διαπερατότητα. Δηλαδή, μπορούν νααναπτυχθούν ακριβείς και ευαίσθητες φασματοφωτομετρικές μέθοδοι, μετρώντας στο άνωμέρος της κλίμακας της διαπερατότητας (Τ=99%).