Investigation of the role of the glial isoform of TAG-1 protein in the organization of mammalian myelinated fibers

Abstract

Myelinated fibers are divided in discrete subdomains around the Nav-enriched nodes of Ranvier: the paranodes, where axoglial interactions occur, the juxtaparanodes, where voltage-gated potassium channels (VGKCs) are aggregated, and the internode. The integrity of these domains is crucial for the function of the axon and the propagation of axon potentials along its length. Perinodal changes have been reported in Multiple Sclerosis (MS) with functional consequences for the axon. TAG-1 (Transient Axonal Glycoprotein-1 or Contactin2 – Cntn2), both an axonal and glial protein, is also found enriched at juxtaparanodes and is responsible for the recruitment and maintenance of VGKC and Caspr2 at these sites, while it was also identified as an autoantigen in a subset of MS patients. Furthermore, the protein has been assigned with crucial roles in mediating processes such as migration, fasciculation and maturation in a variety of neuronal subtypes in the developing central nervous system (CNS).In the first part of the study, in an effort to further study its role in myelination, we focused on the role of TAG-1 in demyelination and remyelination in two different murine models. In the first one, the EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) model, we induced demyelination after activation of the immune system directed against a myelin component, driving autoimmunity which results in spinal cord white matter (WM) pathology and associated clinical symptoms. TAG-1 absence resulted in a delay in the development of neurological symptoms, linked to a reduced recruitment of Tregs in the spinal cord. The second model utilizes a toxin (lysophospatidylοcholine - LPC) to induce focal demyelination in the corpus callosum (cc). Following demyelination, TAG-1 affects microglial and astroglial recruitment to the lesioned area, driving also OPC differentiation. Last but not least, in the absence of TAG-1 another mechanism is driven to cluster VGKCs at JXPs during remyelination.In the second part of our study, we report on alterations of the juxtaparanodal proteins TAG-1, Caspr2 and VGKCs in normal appearing white matter (NAWM), perilesion and chronic lesion areas in post-mortem white matter tissue from MS patients compared to control white matter. We show that the molecular organization and maintenance of JXPs is affected in lesions, perilesions and NAWM in chronic MS through protein and mRNA expression as well as immunohistochemistry. The three molecules analyzed were differentially altered. TAG-1 clustering at JXPs was reduced in NAWM; TAG-1 and Caspr2 are diffused in perilesions and absent in lesion areas. VGKCs were no longer enriched at juxtaparanodes either at the NAWM or the perilesion and demyelinated plaques. While the protein levels of the three molecules showed only a tendency of reduction in the plaques, there was a significant upregulation of Caspr2 mRNA in the lesions accompanied by a transcriptional increase of paranodal Caspr, indicating an axonal homeostatic mechanism.Overall, our study points to novel roles of TAG-1 in demyelination and remyelination in mice, such as a pivotal role in driving autoimmunity, microglial and astroglial recruitment, as well as differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) to mature, myelin-producing, oligodendrocytes (OLs). In chronic MS tissue, the comparative analysis of the juxtaparanodal complex revealed for the first time differential alterations of the three components and a juxtaparanodal vulnerability in NAWM, an area of diffuse pathology lacking demyelination.

Οι εμμύελες ίνες των θηλαστικών διαιρούνται σε διακριτές υποπεριοχές, οι οποίες πλαισιώνουν τους κόμβους του Ranvier, στους οποίους βρίσκονται τα τασεοελεγχόμενα κανάλια νατρίου (voltage gated Na channels - Nav). Δίπλα από τον κόμβο του Ranvier βρίσκονται σε διαδοχή οι λεγόμενες παρακομβικές περιοχές (paranodes - PNs), στις οποίες λαμβάνουν χώρα φυσικές αλληλεπιδράσεις των γλοιακών και αξονικών μεμβρανών, οι εγγύς των παρακομβικών περιοχές (juxtaparanodes - JPXs), στις οποίες γίνεται η συσσώρευση των τασεοελεγχόμενων διαύλων καλίου (voltage-gated K channels - VGKCs) και στη συνέχεια το μεσοκομβικό διάστημα (internode). Η συνοχή των παραπάνω υποπεριοχών είναι υψίστης σημασίας για τη λειτουργία του νευράξονα και την επαγωγή του δυναμικού ενεργείας κατά μήκος του. Ισχυρές αλλαγές επί των περιοχών αυτών έχουν αναφερθεί στη Σκλήρυνση κατά Πλάκας (Multiple Sclerosis - MS), συνοδευόμενες από λειτουργικές συνέπειες για την νευρική λειτουργία. Η πρωτεΐνη TAG-1 (Transient Axonal Glycoprotein-1 ή Contactin2 – Cntn2), η οποία εκφράζεται από τον άξονα και το γλοιακό κύτταρο, εντοπίζεται και αυτή στα JXPs και είναι υπεύθυνη για την μοριακή στρατολόγηση και συγκράτηση των VGKCs και της αξονικής πρωτείνης Caspr2 σε αυτές. Επίσης, η TAG-1 έχει ταυτοποιηθεί ως πιθανό αυτοαντιγόνο σε μια υποκατηγορία ασθενών οι οποίοι πάσχουν από MS και η νευρωνική της μορφή έχει βρεθεί να συμμετέχει σε πολλές διεργασίες όπως η κυτταρική μετανάστευση και διαφοροποίηση, η αξονική δεσμίδωση σε διάφορους τύπους νευρικών κυττάρων στο αναπτυσσόμενο κεντρικό νευρικό σύστημα (Central Nervous System - CNS).Στο πρώτο μέρος της παρούσας μελέτης προσπαθήσαμε να προσεγγίσουμε το ρόλο της TAG-1 στη μυελίνωση, χρησιμοποιώντας δύο μοντέλα απομυελίνωσης σε μύες. Στο πρώτο μοντέλο, αυτό της Αυτοάνοσης Πειραματικής Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - EAE), έγινε η επαγωγή της απομυελίνωσης μετά από την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι μια δομικής πρωτεΐνης της μυελίνης, καταλήγοντας σε παθολογία της λευκής ουσίας του νωτιαίου μυελού και σχετιζόμενα κλινικά συμπτώματα. Απουσία της TAG-1 παρατηρήθηκε καθυστερημένη ανάπτυξη των νευρολογικών συμπτωμάτων, συνδεδεμένη με μειωμένη στρατολόγηση των ανοσορρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων (regulatory T cells - Tregs) στο νωτιαίο μυελό. Στο δεύτερο απομυελινωτικό μοντέλο γίνεται χρήση μιας τοξίνης (λυσοφωσφατιδυλοχολίνη – lysophosphatidylocholine - LPC) για να επαχθεί τοπική απομυελίνωση του μεσολοβίου (corpus callosum - cc). Μετά την επαγωγή, η TAG-1 εμπλέκεται στην μοριακή στρατολόγηση των μικρογλοιακών και αστρογλοιακών κυττάρων στη περιοχή της απομυελίνωσης, επάγωντας και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων των ολιγοδενδροκυττάρων (Oligodendrocyte Precursor Cells – OPCs). Επιπροσθέτως, απουσία της TAG-1 τα VGKCs συσσωρεύονται στα JXPs μέσω ενός εναλλάκτικού μηχανισμού κατά την επαναμυελίνωση.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, αναφέρουμε αλλαγές επί των πρωτεινών των JXPs TAG-1, Caspr2 και VGKCs στην φαινομενικά υγιή λευκή ουσία (normal appearing white matter - NAWM), στις περιοχές γύρω από τις απομυελινωτικές πλάκες (perilesions) και στις απομυελινωμένες περιοχές (lesions or plaques) σε ιστό post-mortem από ασθενείς πάσχοντες από MS σε σχέση με λευκή ουσία ελέγχου. Δείχνουμε ότι η μοριακή οργάνωση και διατήρηση των JXPs βρίσκεται επηρεασμένη σε όλες τις παραπάνω περιοχές μέσω ανάλυσης της πρωτεινικής έκφρασης και των επιπέδων mRNA, αλλά και μέσω πειραμάτων ανοσοϊστοχημείας. Τα τρία μόρια βρέθηκαν να επηρεάζονται σε διαφορετικό βαθμό. Η συσσώρευση της TAG-1 στα JXPs ήταν μειωμένη στη NAWM, ενώ παρατηρήθηκε η διάχυση των TAG-1 και Caspr2 στις περιοχές γύρω και επί των απομυελινωτικών πλακών. Τα VGKCs δεν βρίσκονταν στα JXP σε καμία από τις περιοχές υπό μελέτη. Στο πρωτεϊνικό επίπεδο, αποκαλύψαμε μόνο μια τάση μείωσης των τριών μορίων στις πλάκες, ενώ τα επίπεδα του αξονικού μορίου των PNs, Caspr, βρέθηκαν αυξημένα, πιθανώς λόγω ενός μηχανισμού ομοιόστασης του νευράξονα.Εν κατακλείδι, από τα αποτελέσματα της μελέτης μας προκύπτει η συμμετοχή της TAG-1 σε καινοτόμες βιολογικές διεργασίες κατά την απομυελίνωση και επαναμυελίνωση σε μύες, όπως στην προώθηση της αυτοανοσίας, της μοριακής στρατολόγησης της μικρογλοίας και αστρογλοίας, καθώς και της διαφοροποιήσης των OPCs σε ώριμα ολιγοδενδροκύτταρα (oligodendrocytes - OLs), ικανά να παράξουν ώριμη μυελίνη. Στην χρόνια MS, αποκαλύψαμε για πρώτη φορά την διαφορική διάχυση και ρύθμιση των τριών πρωτεϊνών που καθιστούν το μοριακό σύμπλοκο των JXPs και την ευαισθησία τους στη NAWM, η οποία χαρακτηρίζεται από διάχυτη παθολογία αλλά όχι από απομυελίνωση.