Μελέτη του ρόλου του μορίου κυτταρικής συνάφειας TAG-1 στην οργάνωση και λειτουργία του ενήλικου κεντρικού νευρικού συστήματος τρωκτικών

Abstract

Myelinated fibers are organized into specialized domains that ensure the rapid propagation of action potentials and are characterized by specific protein complexes underlying essential interactions between glial and axonal membranes. These domains are the myelin-free node of Ranvier, the paranodes and the juxtaparanodes. TAG-1 (Transient Axonal Glycoprotein-1), a cell adhesion molecule of the immunoglobulin superfamily, is expressed by neurons as well as by myelinating glia and is concentrated at the juxtaparanodes of adult central and peripheral myelinated fibers. It is essential for the clustering of potassium channels in the juxtaparanodes that are important for the repolarization of the membrane after action potential propagation. More specifically, it forms a tripartite complex with Caspr2 and the potassium channels, whereas in its absence in Tag-1-/- mice, juxtaparanodes of the optic and the sciatic nerves are disrupted, showing diffusion of potassium channels. Morphologically, optic nerves from Tag-1-/- animals display hypomyelination as well as a severe loss of small calibre axons. In the first part of this study we focused on the behavioral analysis of Tag-1-/- mice, examining their cognitive and motor abilities. We show that the absence of TAG-1 results in learning and memory deficits as well as motor coordination defets. We continued with a thorough analysis of the molecular organization of myelinated fibers in various areas of the central nervous system, including those implicated in the behaviors affected in Tag-1-/- mice. We demonstrate that TAG-1 absence results in the disruption of the juxtaparanodal domain of all central myelinated fibers and further causes shortening of the internodes. These molecular defects may underly the behavioral phenotype present in homozygous mutants for TAG-1. In the second part of this study, we aimed to clarify the role of glial TAG-1 in the molecular organization of juxtaparanodes, the morphology of optic nerve fibers as well as the behaviour in mice. This analysis is important since TAG-1 is the only known component of the juxtaparanodal complex expressed by the glial cell. In our attempt to rescue the phenotype of the Tag-1 deficient mice, we generated new transgenic mice (Tag-1-/-;plpTg(rTag-1)), that exclusively express TAG-1 in oligodendrocytes and lack endogenous gene expression. Immunohistochemical analysis clearly demonstrates that glial TAG-1 is sufficient for the proper organization and maintenance of the juxtaparanodal domain in the CNS. Biochemical analysis showed that glial TAG-1 physically interacts with Caspr2 and the potassium channels. Finally, subsequent ultrastructural analysis of the optic nerve as well as a thorough behavioral study of the transgenic mice showed that the expression of glial TAG-1 is sufficient to restore the axonal and myelin deficits as well as the behavioral defects observed in Tag-1-/- animals. Together, these data highlight the pivotal role of myelinating glia on axonal domain differentiation and organization.

Οι εμμύελες ίνες οργανώνονται σε μοριακά και δομικά διακριτές περιοχές που εξασφαλίζουν την ταχεία μεταγωγή του δυναμικού ενεργείας κατά μήκος του νευράξονα. Αυτός ο διαχωρισμός των εμμύελων αξόνων βασίζεται σε αξονογλοιακές αλληλεπιδράσεις στις οποίες βασικό ρόλο διαδραματίζουν μόρια κυτταρικής συνάφειας και δίαυλοι ιόντων. Το μόριο κυτταρικής συνάφειας της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών TAG-1 εκφράζεται από νευρικά και γλοιακά κύτταρα και εντοπίζεται στην εγγύς της παρακομβικής περιοχή των εμμύελων ινών του ενήλικου κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος. Στην περιοχή αυτή η TAG-1 απαιτείται για τη συσσώρευση των διαύλων καλίου, οι οποίοι εμπλέκονται στη σταδιακή επαναπόλωση της μεμβράνης έπειτα από την αγωγή μίας ηλεκτρικής ώσης. Ειδικότερα έχει βρεθεί πως σχηματίζει τριμερές σύμπλοκο με την πρωτεΐνη του άξονα Caspr2 και τους διαύλους καλίου στην εγγύς της παρακομβικής περιοχή. Η απουσία της οδηγεί σε αποδιοργάνωση της περιοχής αυτής με διάχυση των διαύλων καλίου όπως καταδεικνύουν μελέτες στο οπτικό και το ισχιακό νεύρο ομόζυγα μεταλλαγμένων Tag-1-/- μυών. Περαιτέρω μορφολογική ανάλυση του οπτικού νεύρου των Tag-1-/- μυών έδειξε πως υπάρχει υπομυελίνωση των νευρικών ινών και δραματική μείωση των μικρής διαμέτρου αξόνων που εντοπίζονται. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετάμε τη συμπεριφορά των Tag-1-/- ενήλικων μυών σε σύγκριση με τους αγρίου τύπου μύες, όπου διαπιστώνουμε ελλείμματα στις γνωστικές λειτουργίες της μάθησης και μνήμης καθώς και στον κινητικό συντονισμό. Στη συνέχεια, αναλύουμε τη μοριακή οργάνωση των εμμύελων ινών σε διάφορα τμήματα του Κ.Ν.Σ. των Tag-1-/- μυών, συμπεριλαμβανομένων των περιοχών που εμπλέκονται στις προαναφερθείσες συμπεριφορές. Αποδεικνύουμε, πως η απουσία της TAG-1 έχει σαν αποτέλεσμα αποδιοργάνωση της εγγύς της παρακομβικής περιοχής όλων των κεντρικών εμμύελων ινών, ανεξαρτήτως περιοχής και οδηγεί σε βράχυνση των μεσοκομβικών τμημάτων. Οι παραπάνω μοριακές διαταραχές πιθανά ευθύνονται για το συμπεριφορικό φαινότυπο των ομόζυγα μεταλλαγμένων μυών. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας θελήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της γλοιακής TAG-1, απουσία της αξονικής πρωτεΐνης, στην οργάνωση της εγγύς της παρακομβικής περιοχής, στη μορφολογία του οπτικού νεύρου και τη συμπεριφορά των μυών. Η σημασία αυτής της μελέτης έγκειται στο γεγονός ότι η πρωτεΐνη TAG-1 είναι το μόνο γνωστό μόριο που εντοπίζεται στη μεμβράνη του γλοιακού κυττάρου στην εγγύς της παρακομβικής περιοχή και είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία του μοριακού της συμπλόκου. Επιχειρήσαμε να διασώσουμε το φαινότυπο των Tag-1-/- μυών δημιουργώντας νέους διαγονιδιακούς μύες (Tag-1-/-;plpTg(rTag-1)), οι οποίοι εκφράζουν την πρωτεΐνη TAG-1 αποκλειστικά από τα κύτταρα γλοίας, ενώ απουσιάζει η ενδογενής έκφραση (από νευρικά και κύτταρα γλοίας). Φαινοτυπική ανάλυση των διαγονιδιακών ζώων σε σύγκριση με φυσιολογικά και Tag-1-/- έδειξε πως η έκφραση του μορίου TAG-1 μόνο από τα κύτταρα γλοίας είναι ικανή για τη δημιουργία και διατήρηση του συμπλόκου της εγγύς της παρακομβικής περιοχής στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Βιοχημική ανάλυση αποκάλυψε την άμεση αλληλεπίδραση της γλοιακής TAG-1 με τα μόρια Caspr2 και τους διαύλους καλίου που εντοπίζονται στον άξονα. Η μελέτη της μορφολογίας του οπτικού νεύρου των διαγονιδιακών μυών έδειξε πως η αποκλειστική έκφραση της TAG-1 από τα γλοιακά κύτταρα είναι ικανή και επαρκής για την πλήρη αποκατάσταση των ελλειμάτων που παρουσιάζουν οι Tag-1-/- μύες. Τέλος, συμπεριφορική ανάλυση των διαγονιδιακών ζώων αποκάλυψε πως η γλοιακή TAG-1 είναι σε θέση να διασώσει πλήρως τη συμπεριφορά των Tag-1-/- μυών, ενισχύοντας τη σημασία των αξονογλοιακών αλληλεπιδράσεων στη σωστή λειτουργία του νευρικού συστήματος.