Μελέτη της κυτταρικής απόπτωσης σε πειραματικό μοντέλο οξείας παγκρεατίτιδας

Abstract

Introduction: Acinar cell death is a crucial event in acute pancreatitis and may occur either by apoptosis or necrosis. The aim of this study is to investigate the expression of the apoptosis associated proteins Fas/FasL, survivin and cytokeratin 18 in experimentally induced severe acute pancreatitis.Materials and Methods: Acute pancreatitis was induced in 30 rats by injecting 0.2 ml of 4.5% sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct. Sham operated animals (n=30) and 10 normal controls were used for comparisons. Animals were killed at 6, 12, 24, 48, 72 hours and 1 week after operation (5 animals at each time point) and both serum and pancreatic tissue were obtained. The severity of acute pancreatitis was graded by evaluation of interstitial edema, inflammatory infiltration, fatty tissue necrosis, acinar cell necrosis and hemorrhage in pancreatic parenchyma, and by measuring serum amylase levels. Acinar cell apoptosis was detected by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) assay and by the tissue expression of cytokeratin 18. Tissue expressions of Fas and FasL and survivin were evaluated by immunohistochemistry. Serum levels of cytokeratin 18 were detected by an ELISA assay.Results: Sodium taurocholate injection resulted in severe acute necrotizing pancreatitis as early as six hours after taurocholate infusion with gradually increasing severity and a peak at 72 hours, and a significant increase of serum amylase at 6 and 12 hours. Apoptotic acinar cells were observed between 48 and 72 hours. The expression of Fas/FasL, survivin and cytokeratin 18 in pancreatic tissue was induced in comparison with normal controls. Fas expression in acute pancreatitis was higher and statistically significant at 24 hours whereas FasL expression was consistently lower with a statistical significance observed at 12 hours when compared to sham-operated animals. Survivin expression was higher in acute pancreatitis and expression of cytokeratin 18 was higher in pancreatitis and statistically significant at 72 hours. Conclusions: Induction and sequential changes in the expression of Fas/FasL, survivin and cytokeratin 18 occur during taurocholate induced severe acute pancreatitis in rats and their temporal modulation might associate with acinar cell death by apoptosis and the severity of acute pancreatitis.

Εισαγωγή: Ο θάνατος των λοβιακών κυττάρων είναι ένα καίριο γεγονός στην οξεία παγκρεατίτιδα και μπορεί να οφείλεται είτε στην απόπτωση είτε στη νέκρωση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι η διερεύνηση της έκφρασης των σχετιζόμενων με την απόπτωση πρωτεϊνών Fas/FasL, Survivin και κυτταροκερατίνης 18 σε πειραματική σοβαρή οξεία παγκρεατίτιδα.Υλικό και μέθοδος: Προκλήθηκε οξεία παγκρεατίτιδα σε 30 επίμυες, μετά την έγχυση 0,2 ml ταυροχολικού νατρίου 4,5% στον κοινό χοληδόχο-παγκρεατικό πόρο. Τα 30 πειραματόζωα της ομάδας εικονικής επέμβασης και τα 10 υγιή, χρησιμοποιήθηκαν για συγκρίσεις. Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν στις 6,12, 24, 48, 72 ώρες και 1 εβδομάδα από την έναρξη του πειράματος (5 πειραματόζωα σε κάθε χρονική στιγμή) και ελήφθησαν δείγματα ορού και παγκρεατικού ιστού. Η βαρύτητα της οξείας παγκρεατίτιδας εκτιμήθηκε από την αξιολόγηση του διάμεσου οιδήματος, των φλεγμονώδων διηθήσεων, της λιπώδους νέκρωσης, της νέκρωσης των λοβιακών κυττάρων, των αιμορραγικών διαποτίσεων του παγκρεατικού παρεγχύματος και των επιπέδων αμυλάσης ορού. Η απόπτωση των λοβιακών κυττάρων ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο TUNEL και με την ανοσοϊστοχημική έκφραση της κυτταροκερατίνης 18. Η ιστική έκφραση των Fas/FasL και Survivin εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Η έκφραση της κυτταροκερατίνης 18 στον ορό προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ELISA.Αποτελέσματα: Η έγχυση του ταυροχολικού νατρίου είχε ως συνέπεια την εμφάνιση σοβαρής οξείας νεκρωτικής παγκρεατίτιδας με βαθμιαία αυξανόμενη βαρύτητα από τις 6 ώρες έως τις 72 ώρες όπου υπήρχε κορύφωση. Επίσης η αμυλάση του ορού αυξανόταν σημαντικά στις 6 και 12 ώρες από την έγχυση. Η απόπτωση των λοβιακών κυττάρων παρατηρήθηκε μεταξύ 48 και 72 ωρών. Η ιστική έκφραση των Fas/FasL, Survivin, κυτταροκερατίνης 18 συγκρίθηκε με την αντίστοιχη στα φυσιολογικά πειραματόζωα. Η έκφραση του Fas στην ομάδα της παγκρεατίτιδας ήταν υψηλότερη και στατιστικά σημαντική στις 24 ώρες, ενώ η έκφραση του FasL ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα της παγκρεατίτιδας συγκριτικά με την ομάδα εικονικής επέμβασης, με στατιστικά σημαντική διαφορά στις 12 ώρες. Η έκφραση της Survivin ήταν εντονότερη στην ομάδα της παγκρεατίτιδας με και η έκφραση της κυτταροκερατίνης 18 ήταν εντονότερη στην ίδια ομάδα με στατιστικά σημαντική διαφορά στις 72 ώρες.Συμπεράσματα: Οι αλληλοδιάδοχες μεταβολές στην έκφραση των Fas/FasL, Survivin και κυτταροκερατίνης 18 κατά τη διάρκεια της επαγόμενης από την έγχυση ταυροχολικού νατρίου σοβαρής οξείας παγκρεατίτιδας σε επίμυες και η διαμόρφωση τους ως προς το χρόνο, πιθανώς σχετίζονται με την απόπτωση των λοβιακών κυττάρων και τη βαρύτητα της οξείας παγκρεατίτιδας.