Adaptation of arthropod pests in plant allelochemiclas and pesticides, with emphasis on the role of detoxification

Abstract

Arthropod pests seriously threaten food security and human health, as theyattack agricultural crops and transmit various diseases. Their control has beenlargely based on chemical insecticides. However the intense use of insecticides hasled in the development of resistance, mainly achieved by target site resistancemutations and detoxification, enzymes, such as the Cytochrome P450s, theGlutathione S-transferases GSTs and the Carboxylesterases (CCEs). The samedetoxification enzymes also participate in the adaptation of arthropod pests to theirhosts, as they also metabolize – inactivate phytotoxins. In this thesis, I usedtransgenic approaches, bioassays, transcriptomics and biochemical/ functionaltechniques to investigate detoxification mechanisms of major arthropod pests, suchas the Aedes aegypti, the Bactrocera oleae and the Tetranychus urticae, againstxenobiotics.First, the A. aegypti cytochrome P450 CYP9J28 was successfully expressed inDrosophila melanogaster and shown to confer significant levels of resistance in vivo,providing solid evidence for its role in pyrethroid resistance and showing that ectopicexpression in D. melanogaster may be a robust approach for validation of candidateresistance genes.Second, a large transcriptomic dataset of B. oleae was generated and morethan 130 putative detoxification genes were identified and phylogeneticallyclassified. The transcriptome was used for the construction of a microarray tool,which was used, in its pilot application, to study detoxification and adaptationmechanisms of the olive fly against insecticides and olive flesh/phytotoxins,respectively. The pyrethroid resistance study indicated the association of twocytochrome P450 genes with the phenotype. Several detoxification and digestivegenes were found over-expressed upon development in olives (green versus blackversus artificial diet), providing a useful starting point for further investigation.In the last chapter, my study dealt and focused on T. urticae GSTs that hadbeen associated with insecticide resistance by microarray studies. Four GSTs werefunctionally expressed and characterized. TuGSTd14 was found to interact withabamectin, supporting earlier work that GSTs are may play a role in abamectinresistance. Strong evidence were provided that TuGSTd05 catalyzes the conjugationof glutathione (GSH) to cyflumetofen in vitro and the possible site of attack as well askey amino acids possibly implicated in the interaction were identified. This studyrepresents the first functional convincing report for the implication of an acari GST inresistance.

Τα αρθρόποδα παράσιτα αποτελούν απειλή για την ασφάλεια των τροφίμωνκαι τη δημόσια υγεία καθώς καταστρέφουν τις καλλιέργειες και μεταφέρουνεντομομεταδιδόμενες ασθένειες. Ο έλεγχός τους βασίζεται κυρίως στη χρήσηεντομοκτόνων. Ωστόσο, η συχνή τους εφαρμογή έχει οδηγήσει στην ανάπτυξηανθεκτικότητας, η οποία επιτυγχάνεται κυρίως μέσω μεταλλαγών στις πρωτεΐνες-στόχους των εντομοκτόνων και μέσω της δράσης των ενζύμων αποτοξικοποίησης,όπως είναι οι κυτοχρωμικές P450 μονοοξυγενάσες (P450s), οι μεταφοράσες τηςγλουταθειώνης (GSTs) και οι καρβοξυλεστεράσες (CCEs). Τα ίδια ένζυμααποτοξικοποίησης συμμετέχουν και στην προσαρμογή των αρθροπόδων στα φυτά-ξενιστές, καθώς έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν- απενεργοποιούν τιςφυτοτοξίνες. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν προσεγγίσεις μεδιαγονιδιακούς οργανισμούς, βιοδοκιμές, μεθόδοι ανάλυσης μεταγραφώματοςκαθώς και βιοχημικές/ λειτουργικές μελέτες για τη διερεύνηση των μηχανισμώναποτοξικοποίησης ξενοβιοτικών ουσιών στο κουνούπι Aedes aegypti, το δάκο τηςελιάς Bactrocera oleae και το φυτοφάγο άκαρι Tetranychus urticae.Αρχικά, το γονίδιο CYP9J28 του A. aegypti που κωδικοποιεί για κυτοχρωμικήοξειδάση P450 εκφράστηκε επιτυχώς στη Drosophila melanogaster και δείχθηκε ότιπροσδίδει σημαντικά επίπεδα ανθεκτικότητας in vivo, παρέχοντας ισχυρέςαποδείξεις για το ρόλο του στη ανθεκτικότητα στα πυρεθροειδή και δείχνοντας ότιη έκφραση γονιδίων στη D. melanogaster είναι μια ισχυρή προσέγγιση για τηνεπιβεβαίωση του ρόλου υποψηφίων γονιδίων στην ανθεκτικότητα.Στο δεύτερο κεφάλαιο της διατριβής, δημιουργήθηκε ένα μεγάλο σύνολοδεδομένων μεταγραφώματος για το B. oleae και ταυτοποιήθηκαν καικατηγοριοποιήθηκαν φυλογενετικά πάνω από 130 πιθανά γονίδιααποτοξικοποίησης. Τα δεδομένα του μεταγραφώματος χρησιμοποιήθηκαν για τηνκατασκευή μιας πλατφόρμας μικροσυστοιχιών, η οποία εν συνεχείαχρησιμοποιήθηκε πιλοτικά για την μελέτη των μηχανισμών αποτοξικοποίησης καιπροσαρμογής του δάκου έναντι των εντομοκτόνων και του ελαιοκάρπου/φυτοτοξινών, αντίστοιχα. Η ανάλυση της ανθεκτικότητας σε πυρεθροειδή υπέδειξετη συσχέτιση δύο κυτοχρωμικών οξειδασών P450 με το φαινότυπο. Επίσης,μελετήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί προσαρμογής στον ελαιόκαρπο και ηαξιοποίηση του μεσοκαρπίου. Αρκετά γονίδια αποτοξικοποίησης και γονίδια τηςπέψης βρέθηκαν να υπερ-εκφράζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στονελαιόκαρπο, παρέχοντας ένα χρήσιμο σημείο εκκίνησης για περαιτέρω διερεύνηση.Στο τελευταίο κεφάλαιο της διατριβής εκφράστηκαν λειτουργικά καιχαρακτηρίστηκαν τέσσερις μεταφοράσες της γλουταθειώνης (GSTs) του T. urticae,οι οποίες είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνααπό μελέτες μικροσυστοιχιών. Η TuGSTd14 βρέθηκε να αλληλεπιδρά με τοabamectin, ενισχύοντας προηγούμενες μελέτες που υποστηρίζουν ότι οι GSTsενδεχομένως εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα στο abamectin. Ισχυρές αποδείξειςδόθηκαν για την in vitro κατάλυση της σύζευξης της γλουταθειώνης (GSH) στοcyflumetofen από την TuGSTd05 και αναγνωρίστηκε το πιθανό σημείο τηςπροσβολής καθώς και σημαντικά αμινοξέα που πιθανόν να συμμετέχουν στηναλληλεπίδραση. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη πειστική αναφορά γιατη συμμετοχή μιας GST από ακάρεα στην ανθεκτικότητα.