Τhe Achilles' heel of the malaria vector Anopheles coluzzii

Abstract

Malaria is one of the most life-threatening infectious diseases representing a global health concern, with Africa carrying the vast burden. The most effective tools against malaria are insecticides; yet their scale up has resulted in severe insecticide resistance. In the lack of new compounds understanding insecticide resistance molecular mechanisms is fundamental. Based on vector control implementation, legs comprise the first tissue the insecticide bypasses to enter the body. Interestingly, African resistant populations have slower insecticide penetration due to their thicker cuticles. Cuticle, the insect exoskeleton, is a non-cellular layer above the epidermis rich in cuticular proteins (CPs), chitin and lipids, mainly cuticular hydrocarbons (CHCs). During my PhD entitled “The Achilles heel of the malaria vector Anopheles coluzzii’ : I) I analyzed the legs of insecticide resistant An. Coluzzii compared to susceptible controls, II) studied role of an AΤP-Binding Cassette (ABC-transporter) leg transporter in insecticide toxicity and III) provided insights into enzymes implicated in CHC biosynthesis in An. coluzzii and D. melanogaster. Comparative transcriptome analyses of legs from resistant and susceptible mosquitoes and transcriptome analysis of induced legs with deltamethrin (widely-used insecticide) were performed. The findings highlighted that legs of resistant mosquitoes have cuticles, with enhanced expression of cuticular proteins CPs and elevated detoxification processes. Additionally, transcriptomic data of deltamethrin-induced mosquitoes, underlined the divergent response upon insecticide induction with plethora of up-regulated genes including ABC transporters, G-protein coupled receptors (GPCRs) and odorant binding proteins (OBPs) among others. Interestingly, an ATP-binding cassette transporter (ABCH2), up-regulated upon induction was shown to be involved in deltamethrin toxicity. RNAi-silencing followed by deltamethrin toxicity assays almost completely restored susceptibility of the resistant mosquitoes. We found ABCH2 mainly in legs and head appendages and specifically on apical epidermis. Additionally, we provided evidence on the dimeric nature of this half-transporter, based on in silico modelling and in vitro data both indicating that it most probably acts as a homodimer. Further, protein-ligand docking analysis, demonstrate that deltamethrin could be a potential substrate, while silencing this gene in mosquitoes followed by deltamethrin exposure, results in increased penetration of insecticides. These lines of evidence suggest that this transporter is implicated in deltamethrin toxicity, perhaps via pumping out deltamethrin. As CHCs are enhanced in resistant mosquito legs, I studied proteins implicated in their biosynthesis. This takes place in oenocytes, where cytochrome P450 enzymes of 4G family (CYP4Gs) catalyze the last decarbonylation step. We provided the distinct developmental localization patterns of the two An. coluzzii CYP4Gs (AcCYP4G16 and AcCYP4G17), revealed they act as decarbonylases and provided their CHC blends by ectopically expressing them in D. melanogaster, while simultaneously silencing the endogenous oenocyte gene (DmCyp4g1). The data revealed that An. coluzzii CYP4Gs, both exhibit slightly different substrate specificities, with flies expressing CYP4G17 transgene producing more dimethyl-branched hydrocarbon species. This feature was studied in respect to desiccation and toxicity and the aforementioned flies were shown to cope better with these stresses. Since, CYP4Gs are not only found in oenocytes, with the most characteristic example D. melanogaster CYP4G (DmCYP4G15), previously reported in larval heads/brains, we were interested in characterization of this enzyme too. We revealed its decarbonylase activity and the distinct CHCs it produces when ectopically expressed in oenocytes. CYP4Gs of interest (AcCYP4G16, AcCYP4G17, DmCYP4G15) were also functionally expressed in insect cells using Baculovirus system. This is a valuable tool for in vitro substrate screenings. Finally, as all CYP4Gs share a specific, acidic-rich insertion, with unknown contribution to CYP4G function, I generated tools using reverse genetics in D. melanogaster to study its contribution in essentiality. The two deletions we generated, resulted in different phenotypes; the short one resulted in survival, while the longer one in mortality. These results perhaps dictate an essential region on this loop, which probably mediates useful interactions with proteins or with the lipid substrates. Overall, the thesis supports the understanding of the legs of resistant mosquitoes providing an informative, comparative dataset (RNA sequencing data) and going deeper into the mechanisms underlying the resistance phenotype by studying a leg transporter and biosynthetic enzymes of the cuticular hydrocarbons which are the major components of An. coluzzii leg epicuticles. This knowledge may contribute to identifying the Achilles’ heel of the major malaria vector, to tackle insecticide resistance and improve vector control.

Η ελονοσία είναι μία από τις πιο απειλητικές για τη ζωή λοιμώδεις ασθένιες και αποτελεί παγκοσμίως ένα σημαντικό ζήτημα δημόσιας υγείας, με την Αφρική να αντιμετωπίζει το μεγαλύτερο πρόβλημα. Έως τώρα την πιο αποτελεσματική μέθοδος καταπολέμησης της ασθένειας αποτελεί η χρήση χημικών εντομοκτόνων που στοχεύουν στα κουνούπια-φορείς. Απουσία όμως νέων σκευασμάτων, η κατανόηση της ανθεκτικότητας που έχει προκύψει έναντι στα υπάρχοντα εντομοκτόνα είναι υψίστης σημασίας. Ο έλεγχος ενήλικων κουνουπιών φορέων εφαρμόζεται σε ψεκασμένες επιφάνειες κατοικιών και με κουνουπιέρες εμβαπτισμένες με εντομοκτόνο. Βάσει αυτού του τρόπου καταπολέμησης τα πόδια των κουνουπιών αποτελούν τον πρώτο ιστό με τον οποίο έρχεται σε επαφή το χημικό ώστε να περάσει στον οργανισμό και να βρει το στόχο του. Είναι γεγονός ότι σε πληθυσμούς κουνουπιών από την Αφρική, που είναι ανθεκτικοί στα εντομοκτόνα, η εισχώρηση του γίνεται με βραδύτερο ρυθμό λόγω των παχύτερων εξωσκελετών που έχουν σχηματίσει. Ο εξωσκελετός, αποτελεί ένα μη κυτταρικό στρώμα, που εκείνεται πάνω από την επιδερμίδα και είναι πλούσιο σε δομικές πρωτεινες, χιτίνη και λιπίδια, κυρίως επιδερμικούς υδρογονάνθρακες (Cuticular Hydrocarbons, CHCs). Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής μου με τίτλο “Η αχίλλειος πτέρνα του κύριου φορέα της ελονοσίας Anopheles coluzzii” : I) ανέλυσα πόδια ανθεκτικών και ευαίσθητων στα εντομοκτόνα κουνουπιών, ΙΙ) μελέτησα μία πρωτείνη-μεταφορέα της οικογένειας ABC (ATP-binding cassette) που εντοπίζεται στα πόδια των κουνουπιών, ως προς τη συμμετοχή της στην τοξικότητα που προκαλεί το εντομοκτόνο, ΙΙΙ) μελέτησα ένζυμα που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των υδρογονανθράκων του εξωσκελετού του Anopheles coluzzii και της Drosophila melanogaster. Αρχικά, εφαρμόστηκε συγκριτική ανάλυση μεταγραφώματος μεταξύ ποδιών ανθεκτικών και ευαίσθητων στα εντομοκτόνα κουνουπιών, καθώς και μεταξύ ποδιών κουνουπιών μετά από έκθεση σε εντομοκτόνα. Τα ευρήματα της ανάλυσης υποδεικνύουν ότι τα πόδια των ανθεκτικών κουνουπιών εμφανίζουν αυξημένη έκφραση ενζύμων αποτοξικοποίησης κάθως και δομικών πρωτεϊνών του εξωσκελετού. Επιπρόσθετα, από τη συγκριτική ανάλυση των ποδιών των κουνουπιών που είχαν υποστεί έκθεση στο πυρεθροειδές εντομοκτόνο δελταμεθρίνη με δείγματα ελέγχου που δεν είχαν υποστεί έκθεση, εντοπίστηκαν αρκετές πρωτεΐνες-μεταφορείς της οικογένειας ΑΤP-Binding Cassette (ABC-μεταφορείς), υποδοχείς συζευγμένεοι με G-πρωτεΐνες (G-Protein Coupled Receptors, GPCRS) καθώς και πρωτεΐνες δέσμευσης οσφρητικών ουσιών (Odorant Binding Proteins, OBPs) μεταξύ άλλων. Συγκεκριμένα, ασχολήθηκα με έναν ABC-μεταφορέα, της H υποοικογενειας (ABCH2), που εμφανίστηκε να υπερεκφράζεται στα πόδια έπειτα από έκθεση σε δελταμεθρίνη, δείχνταντας την εμπλοκή του στην τοξικοτητα που οφείλεται σε αυτή. Η RNAi σίγηση του μεταφορέα και η επακόλουθη έκθεση των κουνουπιών στο εντομοκτόνο είχε ως αποτέλεσμα την ολική σχεδόν θνησιμότητα των ανθεκτικών κουνουπιών. Εντοπίσαμε, εν συνεχεία, την πρωτεΐνη αυτή στα πόδια και τα κεφάλια (στις κεραίες, την προβοσκίδα και τα οσφρητικά αισθητήρια όργανα) και συγκεκριμένα στην επιδερμίδα τους. Εν συνεχεία, εφαρμόσαμε ανάλυση in silico με σκοπό τη μοντελοποίηση του μεταφορέα υποδεικνύοντας ότι πρόκειται για μόριο που φυσιολογικά δομείται ως ομοδιμερές προκειμένου να είναι λειτουργικό. Αυτή η παρατήρηση, επιβεβαιώθηκε μετά από τη λειτουργική in vitro εκφραση του μεταφορέα σε κύτταρα εντόμων. Έπειτα, πειράματα ελλιμενισμού (docking) για την εύρεση πιθανής αλληλεπίδρασης του μεταφορέα με τη δελταμεθρίνη έδειξαν ότι το μόριο αυτό αποτελεί πιθανό προσδέτη, ενώ σίγηση του μεταφορέα στα κουνούπια είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη διείσδυση δελταμεθρίνης. Τα ευρήματα αυτά συνηγορόυν σε πιθανό ρόλο του μεταφορέα ως αντλία εξόδου της δελταμεθρίνης από τον οργανισμό. Λόγω της αυξημένης παρουσίας των υδρογονανθράκων του εξωσκελετού, στα πόδια των ανθεκτικών κουνουπιών, μελέτησα επίσης πρωτεΐνες-ένζυμα που εμπλέκονται στη βιοσύνθεσή τους. Αυτή λαμβάνει χώρα στα οινοκύτταρα, με τις μονοξυγενάσες του κυτοχρώματος της υποοικογένειας 4G (CYP4G) να καταλύουν την τελευταία αντίδραση αποκαρβονυλίωσης προς παραγωγή υδρογονανθράκων. Μελετώντας τις δύο CYP4Gs (AcCYP4G16 και AcCYP4G17) του An. coluzzii, έδειξα ότι εντοπίζονται σε διαφορετικές κυτταρικές περιοχές κατά την ανάπτυξη, ότι διαθέτουν και οι δύο δυνατότητα αποκαρβονυλίωσης και παραθέτω τα διαφορετικά προφίλ υδρογονανθράκων που η κάθεμια παράγει μετά από εκτοπική έκφραση τους στα οινοκύτταρα της D. melanogaster, με ταυτόχονη σίγηση του ενδογενούς γονιδίου (DmCyp4g1). Σύμφωνα με τα δεδομένα οι δύο CYP4Gs του An. coluzzii εμφανίζουν ελαφρώς διαφορετικές ικανότητες κατάλυσης υποστρωμάτων, μιας και οι D. melanogaster που εκφράζουν τo CYP4G17 διαγονίδιο παράγουν περισσότερους διμέθυλ-υδρογονάνθρακες, πολύ μακριάς αλυσίδας. Το χαρακτηριστικό αυτό μελετήθηκε και ως προς την ικανότητα των μυγών να ανταπεξέρχονται σε συνθήκες αποξήρανσης και τοξικόητητας, με αυτές που παράγουν τους εν λόγω υδρογονάνθρακες να εμφανίζουν πλεονεκτήμα. Μιας και τα CYP4G ενζυμα δεν εντοπίζονται μόνο στα οινοκύτταρα αλλά και σε άλλους ιστούς, με το χαρακτηριστικό παράδειγμα της D. melanogaster CYP4G15 που εντοπίζεται στο νευρικό σύστημα, ασχολήθηκα επίσης με το χαρακτηρισμό αυτού του ενζύμου. Υποδεικνύεται ότι και αυτή η πρωτεΐνη δρα ως αποκαρβονυλάση και παρατίθεται το προφίλ υδρογονανθράκων που παράγει όταν εκφραστεί εκτοπικά στα οινοκύτταρα της Drosophila. Για τα τρία αυτά ένζυμα (AcCYP4G16, AcCYP4G17, DmCYP4G15) επιτεύχθηκε η λειτουργική in vitro έκφρασή τους σε κύτταρα εντόμων, κάτι που αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη και ανίχνευση της καταλυτικής τους ικανότητας σε διάφορα υποστρώματα. Τέλος, μιας και όλα τα ένζυμα της υποοικογένειας CYP4G, διαθέτουν μία επιπλέον, χαρακτηριστική πρωτεϊνική περιοχή, με αξιοσημείωτη παρουσία όξινων αμινοξέων, χρησιμοποίησα εργαλεία γενετικής τροποποίησης για την εκτίμηση της συνεισφοράς της στην, συνειφασμένη με τα οινοκύτταρα, απαραίτητη για τη ζωή λειτουργία των ενζύμων αυτών. Συγκεκριμένα, εφαρμόζωντας δύα διαφορετικές απαλειφές της περιοχής ενδιαφέροντος προέκυψαν δύο διαφορετικοί φαινότυποι: από τη μικρότερη απαλειφή προέκυψαν άτομα με ικανότητα επιβίωσης, ενώ από τη μακρύτερη όχι. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η συγκεκριμένη περιοχή επιτελεί σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του ενζύμου, πιθανά μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες ή λιπιδικά υποστρώματα. Στο σύνολό της αυτή η διδακτορική διατριβή συνηγορεί στην κατανόηση των ποδιών των ανθεκτικών στα εντομοκτόνα κουνουπιών, αφενός παρέχοντας μία συγκριτική ανάλυση δεδομένων μεταγραφώματος και αφετέρου εμβαθύνοντας στους μηχανισμούς που διέπουν τους ανθεκτικούς φαινοτύπους, μέσω της μελέτης μια πρωτεΐνης-μεταφορέα των ποδιών και συγκεκριμένων βιοσυνθετικών ενζύμων των επιδερμικών υδρογονανθράκων, που βρίσκονται σε μεγάλα ποσοστά στα πόδια. Η γνώση αυτή συνεισφέρει στον εντοπισμό της αχιλλείου πτέρνας των κουνουπιών-φορέων της ελονοσίας, ώστε να αντιμετωπιστεί η ανθεκτικότητα , βελτιώνοντας τον έλεγχο των φορέων.