Δομική και λειτουργική οργάνωση των διαμεμβρανικών ελίκων στους μεταφορείς πουρινών της οικογένειας ΝΑΤ

Abstract

This PHD thesis refers to the research of membrane transport proteins, which (a) constitute a large number of gene products in all species (5-15%), (b) have been inadequately studied in the past, due to the limited availability of analytical crystallographic models, (c) conform to functional and specificity mechanisms that have been analyzed in detail only in the recent years. Proteins of such types including for example the serotonin transporter or the glucose-sodium symporter are important for human physiology and disease, are associated with serious genetic disorders (such as cystic fibrosis, Parkinson’s, Alzheimer’s) or are used as targets of some commonly prescribed medicines (such as Prozac, Prilosec). In the project, we use Cys-scanning mutagenesis techniques to dissect the structural and functional organization of a typical purine transporter of the NAT/NCS2 family (nucleobase-cation symporters), namely XanQ, which has been recently cloned and characterized in our laboratory. We apply cross-linking experiments and functional analyses of paired-Cys replacement mutants, in the presence or absence of substrate. The results provide an experimental model for the arrangement of transmembrane segments (alpha helices) in the tertiary structure of XanQ, which describes the conformational changes that characterize the transport mechanism, delineate amino acid residues of the binding site or at positions that sense the conformational changes elicited by substrate binding based also on data from first crystallographic model of uracil homolog transporter of the family UraA. This study is the first systematic approach to the structure-functional arrangement of a protein belonging to an important, evolutionarily ubiquitous family of membrane transporters, which can use many drug analogs as substrates and have not been analyzed to date at high resolution.

Η διδακτορική διατριβή εντάσσεται στην έρευνα των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών μεταφοράς, οι οποίες (α) συνιστούν μεγάλο αριθμό γονιδιακών προϊόντων σε όλα τα είδη οργανισμών (5-15%), (β) δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς στο παρελθόν, λόγω περιορισμένης παραγωγής αναλυτικών τρισδιάστατων δομών από κρυσταλλογραφία, (γ) υπόκεινται σε μηχανισμούς λειτουργίας και εξειδίκευσης που μόλις αρχίζουν να γίνονται κατανοητοί σε αναλυτικό επίπεδο. Πρωτεΐνες του τύπου αυτού όπως ο μεταφορέας σεροτονίνης ή ο συμμεταφορέας γλυκόζης-νατρίου είναι σημαντικές για την ανθρώπινη φυσιολογία και παθογένεση, συνδέονται με την αιτιολογία ή εξέλιξη σημαντικών γενετικών νόσων (π.χ. κυστική ίνωση, Parkinson’s, Alzheimer’s) ή αποτελούν στόχους ορισμένων από τα συχνότερα συνταγογραφούμενα φάρμακα (π.χ. Prozac, Prilosec). Συγκεκριμένα στην διατριβή αναλύονται με τεχνικές κυστεϊνικής σάρωσης (Cys-scanning) η δομική και λειτουργική οργάνωση ενός τυπικού μεταφορέα πουρινών της οικογένειας NAT/NCS2 (nucleobase-cation symporters), ονόματι XanQ, τον οποίο έχουμε κλωνοποιήσει και χαρακτηρίσει πρόσφατα στο εργαστήριό μας. Εφαρμόζονται πειράματα διασταυρωτής σύνδεσης (cross-linking) και λειτουργικής ανάλυσης διπλών μεταλλαγμάτων, παρουσία και απουσία υποστρώματος. Ως αποτέλεσμα δίνεται ένα πειραματικό μοντέλο οργάνωσης των διαμεμβρανικών τμημάτων (α-ελίκων) στην τριτοταγή δομή του XanQ, καταγράφονται οι αλλαγές διαμόρφωσης που χαρακτηρίζουν τον μηχανισμό δέσμευσης/μεταφοράς ξανθίνης, εντοπίζονται κατάλοιπα πλησίον του κέντρου δέσμευσης ή σε θέσεις–«αισθητήρες» για τις αλλαγές διαμόρφωσης που επάγει η δέσμευση υποστρώματος, σύμφωνα και με δεδομένα που προκύπτουν από την πρώτη δημοσιευμένη κρυσταλλογραφική δομή του ομολόγου μεταφορέα της ουρακίλης της οικογένειας UraA. Πρόκειται για την πρώτη συστηματική ανάλυση αυτού του τύπου σε μια σημαντική, εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια μεμβρανικών πρωτεϊνών που χρησιμοποιεί ως υποστρώματα πολλά δομικά ανάλογα φαρμάκων, και δεν έχει αναλυθεί έως σήμερα διεξοδικά σε υψηλή ευκρίνεια.