Υπερέκφραση - καθαρισμός και μελέτη σχέσεων δομής - λειτουργίας των μεταφορέων NAT σε πρότυπο βακτηριακό σύστημα

Abstract

Our lab has recently cloned and functionally characterized YgfO, a specific, high-affinity xanthine:Η+ symporter from Escherichia coli Κ-12, a member of the nucleobase-ascorbate transporter (NAT/NCS2) family. With introduction of appropriate epitope tags at the C terminus (biotin-acceptor domain or His10-tail) and application of the Cys-scanning mutagenesis technology, a model bacterial system was developed for the study of structure-function relationships of the NAT transporters, based on the YgfO permease (Karatza P.). Despite considerable progress, today, important aspects of the topology, active site mapping and the mechanism of YgfO remain unanswered and there are no high-resolution structures available for any member of this family. The aims of this thesis was to develop a protocol for the overexpression, purification and a first structural characterization of YgfO, with biophysical methods, to apply a first experimental study of the topology of YgfO with substituted-cysteine accessibility method (SCAM), and to further study the role of the NAT signature motif, 324QNXGXXXXTG333, which had been indicated to contain important determinats for the mechanism. We developed a protocol for the large-scale overexpression and purification of YgfO in detergent solution (n-dodecyl- β,D-maltoside, DDM) with a yield of 0.7 mg of purified protein per L of cell culture. It was found that the purified YgfO retains a high alpha-helical content (with circular dichoism spectroscopy), recognizes specifically the substrate (xanthine) but not 7- methylxanthine which is not a ligand for YgfO (with tryptophan fluorescence spectroscopy) and retains local secondary structure elements at the NAT motif region (with site-directed spin labeling of mutants Q324C and R337C and EPR spectroscopy). While searching for other homologs to be used as alternative sources for purification, from thermophilic microorganisms, we cloned and characterized functionally a close YgfO homolog from the Gram-positive thermophilic bacterium Moorella thermoacetica, which was found to transport xanthine at 37 °C, pH 6.6-6.8, in the heterologous expression system of E. coli. We analyzed general feautures of the topology of YgfO with substituted-cysteine accessibility method (SCAM) which is based on the Cys-scanning technology. We engineered single-Cys mutants at the tips of the predicted hydrophilic loops (A48C, R78C, S109C, L142C, A176C, S206C, T243C, S295C, L319C, A366C, R394C, I419C) and assayed for their reactivity with the hydrophilic, membrane-impermeable reagent MTSES-, in right-side out membrane vesicles (RSOs). Our data show that there is a clear alternation of solvent accessibility for the region between transmembrane helices (TMs) 1 and 8, as expected from the in silico prediction algorithms, while, at the C-terminal third of the molecule (TMs 9-12), all the single-Cys residue positions were found to be accessible, contraty to the predictions of the models. This discrepancy is possibly due to the presence of amphipathic helical segments that cross the membrane only partially and/or reentrant loops, giving a perturbed topology at the C-terminal part of the molecule. Using gene fusion with the green fluorescent protein (GFP), we confirmed that the Ctail of YgfO is cytoplasmic, consistent with previous proteomic analyses from the group of Dr. Gunnar von Heijne (Stockholm).

Πρόσφατα, κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίσθηκε λειτουργικά από την ερευνητική μας ομάδα ο μεταφορέας YgfO του εντεροβακτηρίου E. coli Κ-12, μέλος της οικογένειας NAT/NCS2, o οποίος εδείχθη ότι λειτουργεί ως ειδικός, υψηλής συγγένειας συμμεταφορέας ξανθίνης: Η+. Με την εισαγωγή κατάλληλων αλληλουχιών-επιτόπων στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης [περιοχή δέσμευσης βιοτίνης (BAD), αλληλουχία 10 συνεχόμενων καταλοίπων His (His10)] και εφαρμογή των μεθοδολογιών της μεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής σάρωσης (Cysscanning mutagenesis) αναπτύχθηκε ένα πρότυπο βακτηριακό σύστημα μελέτης των σχέσεων δομής-λειτουργίας για τους μεταφορείς NAT, με βάση το μόριο του YgfO (Καρατζά Π.). Παρά τα σημαντικά ευρήματα, παραμένουν αρκετά αναπάντητα ερωτήματα για την τοπολογία, για το ενεργό κέντρο του μορίου, για άλλες σημαντικές περιοχές καθώς και τον μηχανισμό λειτουργίας του YgfO. Επίσης, δεν υπάρχουν έως τώρα δεδομένα δομικών κρυσταλλογραφικών αναλύσεων για καμιά πρωτεϊνη της οικογένειας NAT. Με βάση τα παραπάνω, στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου απομόνωσης και αρχικού δομικού χαρακτηρισμού του YgfO, η εξέταση της γενικής τοπολογικής του οργάνωσης με εργαστηριακές μεθόδους και μια εμβάθυνση στο ρόλο του μοτίβου-υπογραφή ΝΑΤ, 324QNXGXXXXTG333, που είχε δειχθεί από προηγούμενες μελέτες μεταλλαξιγένεσης ότι περιλαμβάνει σημαντικούς καθοριστές για τον μηχανισμό λειτουργίας του YgfO. Αναπτύχθηκε καταρχήν ένα πρωτόκολλο για την υπερέκφραση και καθαρισμό του YgfO σε μεγάλη κλίμακα σε διάλυμα απορρυπαντικού (n-δωδεκυλο-β,D-μαλτοπυρανοσιδίου, DDM), με τελική απόδοση απομονωμένης πρωτεΐνης ~0.7 mg/L καλλιέργειας. Η μελέτη αυτή οδήγησε στην απομόνωση και έναν αρχικό δομικό χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης YgfO σε διάλυμα DDM (0.008% w/v), που έδειξε ότι η απομονωμένη πρωτεΐνη διατηρεί υψηλό ποσοστό περιοχών α- έλικας (φασματοσκοπία CD) και μπορεί να αναγνωρίζει ειδικά το υπόστρωμά της (ξανθίνη) αλλά όχι ένα ανάλογο ξανθίνης που δεν δεσμεύεται (7-μεθυλοξανθίνη) (φθορισμομετρία τρυπτοφανών), ενώ φαίνεται να διατηρεί και επιμέρους στοιχεία της δευτεροταγούς δομής της στην περιοχή του μοτίβου-υπογραφή ΝΑΤ (φασματοσκοπία EPR και SDSL). Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η απομονωμένη πρωτεΐνη διατηρεί λειτουργικά και δομικά στοιχεία της και ότι το πρωτόκολλο απομόνωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για περαιτέρω δομικές μελέτες. Εξάλλου, στα πλαίσια των προσπαθειών μας για την υπερέκφραση και απομόνωση ομολόγων μεταφορέων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς, ως εναλλακτικών επιλογών, κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίσθηκε λειτουργικά ένα συγγενές ομόλογο του μεταφορέα YgfO από το θερμόφιλο Gram-θετικό βακτήριο Moorella thermoacetica, το οποίο εδείχθη ότι λειτουργεί ως μεταφορέας ξανθίνης στους 37 °C, pH 6.6-6.8, στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης της E. coli.