Μοριακή επιδημιολογία και μελέτη αντοχής στα αντιμυκητιακά, στελεχών Candida σε ασθενείς με σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (AIDS)

Abstract

HIV positive patients are susceptible to a wide array of microbial infections. The oral cavity and perioral areas are common anatomical sites that microbial infections affect causing severe mucosal and skin lesions. Oropharyngeal candidiasis (OPC) in HIV-positive individuals is still common, although newer antiretroviral therapies, such as HAART/PI-HAART, had initially a positive impact on limiting erythematous and pseudomembranous candidiasis. The present study aimed at evaluating (a) the influence of newer antiretroviral therapies in the frequency of OPC and their impact on the yeast species responsible, by comparing populations of HIV/AIDS individuals prior to, and after, establishment of HAART; (b) record antifungal susceptibility trends of isolates from patients before and after the introduction of HAART; (c) resolve the molecular base of the most common and prominent resistance patterns. At first, the Candida species OPC infection frequencies was established from 349 AIDS patients in the G. Gennimatas General Hospital Special Infections Unit, followed by recording outcomes of antifungal regimens. The 271 OPC Candida spp. isolated from a total of 665 samples were characterized by standard phenotypic methods comprising microscopy culture and carbohydrate assimilation tests. The in vitro resistance of single colonies to fluconazole, voriconazole, amphotericin B, 5-fluorocytocine, itraconazole, ketoconazole and caspofungin were determined using both E-test and the CLSI reference microdilution method (M27 A2). Successive sampling in 19 patients with recurring candidiasis yielded 32 yeast isolates, of which 22 were C. albicans. This species was prominent in all cases, regardless patients undergoing non-HAART or HAART antiretroviral therapy. Interestingly, Candida non-albicans occurred significantly more frequently (p > 0.5) in high viral load and/or low CD4 counts in patients with OPC. PCR-sequencing of fluconazole-resistant C. albicans isolates revealed homogenous resistance genotypes (MDR-, ACT1+, CDR +, ERG11+), without any point mutations, while resistance within C. albicans isolates was 22,4% compared to 44% for Candida non-albicans isolates, in accordance with international data. Furthermore, the study on C. albicans fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible identification of specific subtypes by PFGE-Not1 RFLP showed that fluconazole resistance is not correlated with any specific C. albicans subtype. Overall, C. albicans were found 100% susceptible to voriconazole. As different Candida species show variable susceptibility to antifungals, species level identification of isolates followed by susceptibility testing can assist targeted antifungal therapy in HIV/AIDS patients with OPC, regardless the antiretroviral regimens administered.

Ο ιός HIV ευθύνεται για ένα ευρύ φάσμα μικροβιακών λοιμώξεων. Το στόμα και η περιστοματική περιοχή αποτελούν θέσεις συχνής εκδήλωσης βλαβών σε ασθενείς μολυσμένους με τον ιό, με το εύρος των βλαβών σχεδόν πάντα εξαιρετικά μεγάλο. Μια εκ των βλαβών είναι η καντιντίαση του στόματος, βλάβη η οποία είναι δυνατόν να εκδηλωθεί με δύο τουλάχιστον κλινικές μορφές: 1. Ως ερυθηματώδης μορφή, κλινικά εκδηλούμενη ως ερυθρή περιοχή που συνήθως εντοπίζεται στη ραχιαία επιφάνεια της γλώσσας και στην υπερώα. Μερικές φορές συνυπάρχουν λευκές κηλίδες ή πλάκες. 2. Ως ψευδομεμβρανώδης μορφή, η οποία εκδηλώνεται με λευκές ή υποκίτρινες κηλίδες ή πλάκες, που μπορεί να εντοπίζονται σε κάθε περιοχή του στόματος και που αποκολλώνται αφήνοντας ερυθρή επιφάνεια. Κατά την πρώτη πρόοδο, διερευνήθηκε η συχνότητα των λοιμώξεων από είδη Candida στη στοματοφαρυγγική κοιλότητα ασθενών με AIDS που παρακολουθούνταν στη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων του Π.Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς» και εκτιμήθηκε η ανταπόκριση των ασθενών στην χορήγηση αντιμυκητιασικής αγωγής. Προσδιορίσθηκε η συχνότητα της in vitro αντοχής των αιτιολογικών παραγόντων της στοματοφαρυγγικής καντιντίασης στην φλουκοναζόλη (η οποία αποτελεί και το φάρμακο εκλογής για χημειοπροφύλαξη στους ασθενείς αυτούς) και ακολούθησε η εκτίμηση της ανταπόκρισης τους στην αγωγή. Κατά την πρώτη φάση της διδακτορικής διατριβής, ελήφθησαν στοματοφαρυγγικά επιχρίσματα από 145 ασθενείς με AIDS σταδίων Β2, B3 και C3. Σε 22 από τους 145 ελήφθησαν διαδοχικά δείγματα κατά τη διάρκεια της θεραπείας και μετά το πέρας αυτής. Τα δείγματα ελέγχονταν με άμεση μικροσκοπική εξέταση και καλλιέργεια στα εκλεκτικά και διαφοροποιητικά θρεπτικά υποστρώματα Malt extract agar και Sabouraud dextrose agar με χλωραμφαινικόλη, καθώς και σε CHROMAgar Candida®. Η φαινοτυπική ταυτοποίηση στηρίχθηκε στη μικροσκοπική μελέτη της μορφολογίας κάθε απομονούμενου στελέχους μετά από ανάπτυξη στα ειδικά θρεπτικά υποστρώματα και μετά από αξιολόγηση της αφομοιωτικής ικανότητας των υδατανθράκων κάθε στελέχους. Μονές αποικίες από κάθε στέλεχος ελέγχονταν με πρότυπη μεθοδολογία (M27 A2, CLSI) και με E-test ως προς την ευαισθησία τους στα ακόλουθα αντιμυκητιακά φάρμακα: κετοκοναζόλη, ιτρακοναζόλη, φλουκοναζόλη, βορικοναζόλη, φλουροκυτοσίνη, αμφοτερικίνη Β, και καπσοφουνγκίνη. Κατά την δεύτερη φάση, και κατά τη χρονική περίοδο 1995-2005, είχαν μελετηθεί συνολικά 349 ασθενείς και είχαν ληφθεί 665 κλινικά δείγματα. Εκ των 665 δειγμάτων 237 (35,6%) ήταν θετικά για Candida. Εκ των θετικών δειγμάτων απομονώθηκαν συνολικά 271 στελέχη ειδών Candida. 19 ασθενείς παρουσίασαν επιμένουσα, υποτροπιάζουσα λοίμωξη υπό αγωγή με φλουκοναζόλη και από αυτούς απομονώθηκαν συνολικά 32 στελέχη ζυμοειδών μυκήτων (22 εξ’ αυτών Candida albicans) λόγω συναπομόνωσης πλέον του ενός είδους. Με δύο εξαιρέσεις, όλες οι συναπομονώσεις αφορούσαν και Candida albicans , κάτι που αποδεικνύει την ευρύτατη εξάπλωσή της στο στοματικό περιβάλλον και ως χλωρίδα και ως παθογόνο. Το είδος C. albicans ήταν αυτό που απαντήθηκε πιο συχνά, είτε ο ασθενής δεν ελάμβανε καμία αγωγή (69,2%), είτε έκανε λήψη αναστολέων πρωτεασών (ΑΠ-PIs) (62,9%) ή άλλης αγωγής (77,4%). Σημειώνεται ότι η απομόνωση Candida μη-albicans στις καλλιέργειες επιτήρησης ασθενών που παρακολουθούντο στη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων έχει υψηλή συχνότητα και απομονώνεται από ασθενείς με υψηλό Ιικό Φορτίο. Έλεγχος με PCR ακολουθούμενη από αλληλούχηση απέδειξε ότι τα γονίδια αντοχής στη φλουκοναζόλη ανθεκτικών στελεχών της C. albicans ήταν σε όλες τις περιπτώσεις τα ίδια (απουσίαζε σταθερά το MDR ενώ εμφανίζονταν τα ACT1, CDR, ERG11), χωρίς πολυμορφισμούς στις αλληλουχούμενες περιοχές. Η μελέτη μοριακής επιδημιολογίας ανθεκτικών στελεχών Candida albicans στη φλουκοναζόλη έγινε με πολυμορφισμό μήκους περιοριστικού θραύσματος DNA, μετά από ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο πεδίο (PFGE-RFLP). Για τα 13/22 στελέχη Candida albicans που απομονώθηκαν με αντοχή στη φλουκοναζόλη δεν καταγράφηκε συσχέτιση συγκεκριμένων υποτύπων με την αντοχή στη φλουκοναζόλη. Γενικώς αντοχές των C. albicans στη φλουκοναζόλη καταγράφτηκαν σε ποσοστό 22,4% επί του συνόλου των ελεγχθέντων στελεχών και 44% για τα στελέχη των Candida μη-albicans. Το ποσοστό αυτό δεν διαφέρει από τα ποσοστά που αναφέρονται διεθνώς για στελέχη που απομονώνονται από την ομάδα των HIV/AIDS ασθενών. Αξιοσημείωτο είναι ότι η τριαζόλη, βορικοναζόλη, παρουσιάζει εξαιρετικά χαμηλές τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης έναντι των C. albicans (ευαισθησία 100% στη βορικοναζόλη), ενώ αντοχές (MIC >1 μg/ml) καταγράφτηκαν για στελέχη Candida μη-albicans (15% αντοχή στη βορικοναζόλη). Οι τιμές που καταγράφτηκαν δεν διαφέρουν από τα διεθνώς αναφερόμενα δεδομένα. Εξ’ αυτών η C. krusei παρουσιάζει συγγενή αντοχή στην φλουκοναζόλη και το φάρμακο αυτό κρίνεται ακατάλληλο για την αντιμετώπιση της ενώ η C. dubliniensis και C. tropicalis αναπτύσσουν αντοχή μετά από την έκθεση τους στο φάρμακο. Συνεπώς, η ταυτοποίηση κατά είδος ακολουθούμενη από αντιμυκητόγραμμα κρίνονται απαραίτητα σε ασθενείς με ιστορικό στοματοφαρυγγικής καντιντίασης οφειλόμενης σε C. dubliniensis και C. tropicalis.