Η ανεύρεση συσχέτισης, κλινικών χαρακτηριστικών, ασθενών με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα και πρωτεϊνικής –γονιδιακής έκφρασης των αδενοκαρκινωμάτων του παχέος εντέρου, όπως εξειδικεύτηκε στην m-RNA έκφραση της καλλικρεΐνης 4 (KLK-4)

Abstract

Colorectal cancer of the large bowel and rectum is a major medical-social problem due to the continuous increasing frequency and high mortality. Colon cancer is the fourth most common cancer after breast, lung and prostate cancer and the second most frequent cause of death after lung cancer.The colon cancer is 95% adenocarcinoma, which originates from a single layer column epithelium and shows varying degrees of differentiation. A variety of risk factors have been linked to colon cancer including genetic factors, age, sex, environmental exposures, daily life habits (diet, smoking, obesity and lack of exercise)and other diseases of the colon that are pre-cancerous conditions such as idiopathic inflammatory bowel disease, ulcerative colitis & Crohn, adenomatous polyps, familial polyposis, hereditary non-polyposis syndrome, colon cancer Lynch I & II.In the past few years, the death rate caused by Colorectal cancer has been reduced, mainly because of the increased screening based on serum markers, such as carcinoembryonic antigen, endoscopic technology and improved treatment of the disease.There is an increasing demand for biomarkers in colon cancer for risk assessment, early detection, and prognosis.Tissue-based biomarkers have been proposed as possible prognostic markers and predictors of response to treatment. Proteases may represent prognostic biomarkers, as they are involved in cancer progression.Human tissue kallikrein-related peptidases are a family of 15 secreted serine proteases which are detected in differentiated tissues, located at chromosome 19q13.4. The kallikrein 4 (KLK4) is a (trypsin-like) serine protease that belongs to the family of the kallikrein-related peptidases (KLKs), the members of which are expressed in adenocarcinoma tissues, the regulation of which is attained by steroid hormones as in several other malignancies, including the cancer of large bowel. A recent study has revealed that the KLK4 represents a new endogenous activator of the receptors which are activated by proteases-1 (PAR1) in HT-29 cells of the adenocarcinoma of the large bowel, inducing the signaling of the receptors which are activated by proteases-1 (PAR1) and subsequent the ERK1 / 2 activation.The purpose of this study was to analyze the expression of mRNA of the KLK4 in samples of the large bowel adenocarcinomas and examine the prognostic value and potential clinical application, as a new molecular tissular biomarker for the adenocarcinoma of the large bowel . For this purpose, the total RNA was isolated from primary tumors of 81 patients with adenocarcinoma of the of large bowel and cDNA preparation by reverse transcription. A highly sensitive real-time PCR methodology was developed to quantify the mRNA of KLK4 and then carry out the analysis of the expression of mRNA of KLK4, using the B2M reporter gene and the application of the comparative methods Ct (2-ΔΔCT). In the present study we have proved, for the first time, that the levels of expression of mRNA of KLK4 are significantly associated with the clinical stage of the disease and the degree of tumor differentiation, the size, and the lymph node status. The survival curves of Kaplan-Meier have shown that patients with adenocarcinoma of the large bowel and positive expression of mRNA of KLK4 have shorter disease-free survival (DFS). The retrograde Cox analysis among all patients indicate that the overexpression of the KLK4 is an unfavorable prognostic tissue biomarker provided effectively, reduces the disease-free survival (DFS), regardless of the status of the lymph nodes of patients and tumor size. Our findings suggest that the expression of mRNA of KLK4 can be seen as a new potential tissue biomarker predicting the short-term relapse of the adenocarcinoma of the large bowel.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου και ορθού αποτελεί μείζον ιατροκοινωνικό πρόβλημα λόγω της συνεχούς αυξανόμενης συχνότητας και της υψηλής θνησιμότητας.Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο 4ος σε συχνότητα καρκίνος μετά τον καρκίνο του μαστού, των πνευμόνων και του προστάτη και η 2η πιο συχνή αιτία θανάτου μετά από τον καρκίνο του πνεύμονα.Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι κατά 95% αδενοκαρκίνωμα, που εξορμάται από κυλινδρικό μονόστιβο επιθήλιο και εμφανίζει ποικίλου βαθμού διαφοροποίηση.Μια ποικιλία παραγόντων κινδύνου έχουν συνδεθεί με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων των γενετικών παραγόντων, ηλικία, φύλο, έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, τις καθημερινές συνήθειες ζωής (διατροφή, κάπνισμα, παχυσαρκία και η έλλειψη σωματικής άσκησης),καθώς και άλλες παθήσεις του παχέος εντέρου που αποτελούν προ-καρκινικές καταστάσεις όπως η ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος του εντέρου-Ελκώδη κολίτιδα&Crohn, αδενωματώδεις πολύποδες, οικογενής πολυποδίαση, σύνδρομο κληρονομικού μη πολυποδιασικού καρκίνου του παχέος εντέρου Lynch I&II. Στη διάρκεια των τελευταίων ετών, το ποσοστό θανάτων που προκαλούνται από τον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει μειωθεί, κυρίως λόγω της αυξημένου προληπτικού ελέγχου που βασίζεται στους βιοδείκτες του ορού, όπως το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο, τον ενδοσκοπικό έλεγχο και τη βελτίωση της θεραπείας της νόσου . Υπάρχει μια αυξανόμενη ζήτηση για βιοδείκτες του καρκίνου του παχέος εντέρου για την αξιολόγηση του κινδύνου, την έγκαιρη διάγνωση, και την πρόγνωση. Οι ιστικοί βιοδείκτες έχουν προταθεί ως πιθανοί δείκτες πρόγνωσης και αξιολόγησης της ανταπόκρισης στη θεραπεία.Οι πρωτεάσες μπορεί να αποτελέσουν μια ομάδα προγνωστικών βιοδεικτών, δεδομένου ότι εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου.Οι ανθρώπινες ιστικές Καλλικρεΐνες είναι μια ομάδα 15 πρωτεασών σερίνης, οι οποίες έχουν ανιχνευτεί σε διαφοροποιημένους ιστούς και εντοπίζονται στο χρωμόσωμα 19q13.4.Η Καλλικρεΐνη 4(KLK4) είναι μια πρωτεάση σερίνης με δράση τύπου θρυψίνης(trypsin-like),που ανήκει στην οικογένεια των πεπτιδασών συγγενών της καλλικρεΐνης(kallikrein-related peptidases-KLKs),τα μέλη της οποίας εκφράζονται σε αδενοκαρκινώματα που προέρχονται από ιστούς των οποίων η ρύθμιση πραγματοποιείται από στεροειδείς ορμόνες καθώς και σε αρκετές άλλες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι η KLK4 αντιπροσωπεύει ένα νέο ενδογενή ενεργοποιητή των υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες-1 (PAR1) στα HT-29 κύτταρα του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου, επάγοντας την σηματοδότηση των υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες-1 (PAR1) και μετέπειτα την ERK1 / 2 ενεργοποίηση. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αναλύσει την έκφραση του mRNA της KLK4 σε δείγματα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου και να εξετάσει την προγνωστική της αξία και την πιθανή κλινικής της εφαρμογή, ως νέος μοριακός ιστικός βιοδείκτης για το αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Για το σκοπό αυτό, απομονώθηκε το ολικό RNA από πρωτοπαθείς όγκους από 81 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, και παρασκευή cDNA από αντίστροφη μεταγραφή. Μια εξαιρετικά ευαίσθητη σε πραγματικό χρόνο PCR μεθοδολογία αναπτύχθηκε, για την ποσοτικοποίηση του mRNA της KLK4 και ακολούθως πραγματοποίηση της ανάλυσης της έκφρασης του mRNA της KLK4, χρησιμοποιώντας τοB2M ως γονίδιο αναφοράς και την εφαρμογή των συγκριτικών μεθόδων CT (2-ΔΔCT).Στην παρούσα μελέτη έχουμε αποδείξει, για πρώτη φορά, ότι τα επίπεδα της έκφρασης του mRNA της KLK4 συνδέονται σημαντικά με το κλινικό στάδιο της νόσου, καθώς και με το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου, το μέγεθος, και την κατάσταση των λεμφαδένων. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξαν ότι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου και θετική έκφραση του mRNA της KLK4 έχουν μικρότερη ελευθέρας νόσου επιβίωση (DFS). Η Cox παλίνδρομη ανάλυση στο σύνολο των ατόμων των ασθενών δηλώνει ότι η υπερέκφραση της KLK4 αποτελεί δυσμενή προγνωστικό ιστικό βιοδείκτη που προβλέπει αποτελεσματικά ελαττωμένη την ελεύθερης νόσου επιβίωση(DFS), ανεξάρτητα από την κατάσταση των λεμφαδένων των ασθενών και το μέγεθος του όγκου. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η έκφραση του mRNA της KLK4 μπορεί να θεωρηθεί ως ένας νέος πιθανός ιστικός βιοδείκτης πρόβλεψης της βραχυπρόθεσμης υποτροπής του αδενοκαρκινώματος του παχεος εντέρου.