Απομόνωση, χαρακτηρισμός και κρυσταλλική δομή της χαρυβδίνης, μιας νέας πρωτεΐνης, από τον οργανισμό Charybdis maritima. Ανάπτυξη βιοαισθητήρα που βασίζεται σε φωτοσύστημα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων

Abstract

Α. In the present work, we describe the purification, characterization and structural determination of charybdin, a novel 29kDa protein from bulbs of Charybdis maritima agg. Charybdin was characterized by biochemical methods and its structure determined by X-ray crystallography. The DNA sequence, and derived amino acid sequence, revealed a significant homology with various ribosome inactivating proteins (RIPs) Although charybdin inhibited the rabbit reticulocyte translation system, the estimated IC50 value of 24nM indicates that it is not such a strong inhibitor of protein synthesis as other RIPs. Single crystals were grown in the cold room from PEG6000 solutions. Diffraction data collected to 1.6 A resolution led to the protein structure with the Molecular Replacement method. The active site of RIPs, which contains four key amino acid residues, is highly conserved. Although the three of the four key residues are present at the active site of charybdin, the fourth residue, which is an invariant Tyr80 (ricin numbering) among more than 360 RIP sequences known to date, is substituted by Val. Β. A screen-printed electrodes based sensor, with immobilised photosynthetic material was successfully developed and tested for detection of herbicides inhibiting photosynthesis. Upon illumination of the photosynthetic material a signal from a reduced mediator was recorded amperometrically. The added herbicide inhibits the photosynthetic process and decreases the reduction of the mediator. The decrease in the measured current is proportional to the herbicide concentration. The spinach thylakoid membranes successfully immobilised onto the sensor surface using cross-linking with glutaraldehyde and bovine serum albumin, gave reproducible and sensitive measurements. The developed system allowed reliable detection of herbicides with a detection limit ranging from 10 to 300nM, depending on the type of herbicide and with a measured lifetime up to 23 hours. In parallel and compared to the thylakoid membranes, Chlamydomonas reinhardtii mutant cells were immobilised and tested to assure a higher biological stability of the biosensor. Preliminary analysis of river water samples using this sensor was also performed indicating good correlation between the data obtain with the biosensor and the ones obtained after GC-MS analysis.

Το πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας αναφέρεται στο χαρακτηρισμό μια νέας πρωτεΐνης, που απομονώθηκε από βολβούς του οργανισμού Charybdis maritimα, και ονομάστηκε χαρυβδίνη. Το ενδιαφέρον για το συγκεκριμένο οργανισμό οφείλεται στο γεγονός ότι περιέχει ένα αρκετά μεγάλο αριθμό ενώσεων με σημαντικές φαρμακευτικές ιδιότητες. Η χαρυβδίνη απομονώθηκε σε καθαρή μορφή και παρήχθησαν κρύσταλλοι οι οποίοι και έδωσαν δεδομένα περίθλασης σε διακριτικότητα 1,6A. Τα δεδομένα περίθλασης αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών της δομή της, ενώ προσδιορίστηκε επίσης η αλληλουχία DNA καθώς και η αμινοξική αλληλουχία. Η σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων της χαρυβδίνης με αλληλουχίες μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών έδειξε ότι η χαρυβδίνη είναι μέλος μια σημαντικής οικογένειας πρωτεϊνών οι οποίες αναστέλλουν μη αντιστρεπτά τη δράση των ριβοσωμάτων (Ribosome Inactivating Proteins - RIP). Η χαρυβδίνη αποτελείται από μια ενιαία πολύπεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος περίπου 29 kDa, η οποία (μέσω ενός μηχανισμού απογλυκοζιλίωσης) αναστέλλει την πρωτεϊνική μετάφραση σε διαλυμένα δίκτυο-ερυθροκύτταρα με IC50 24nM. Χαρακτηριστικό της χαρυβδίνης είναι η διαφοροποίηση εξαιτίας μετάλλαξης, ενός εκ των τεσσάρων αμινοξέων που σχηματίζουν το ενεργό της κέντρο. Συγκεκριμένα, στη θέση 79 του ενεργού κέντρου μια βαλίνη έχει αντικαταστήσει το κατά τα άλλα συντηρημένο, μεταξύ 360 πρωτεϊνών RIP, κατάλοιπο τυροσίνης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας αναφέρεται στην ανάπτυξη ενός αμπερομετρικού αισθητήρα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων, χρησιμοποιώντας φωτοσυνθετικό υλικό ακινητοποιημένο σε ηλεκτρόδια μεταξοτυπίας. Η ακινητοποίηση πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο της μοριακής διασύνδεσης παρουσία BSA και γλουταραλδεΰδης. Η αρχή ανίχνευσης ζιζανιοκτόνου βασίζεται στην παρεμπόδιση της ηλεκτρονιακής ροής στο φωτοσύστημα ΙΙ εξαιτίας της παρουσίας του ζιζανιοκτόνου, το οποίο εμποδίζει τη φωτοσυνθετική διαδικασία μειώνοντας τη αναγωγή του μεταφορέα ηλεκτρονίων με συνέπεια την μείωση του επαγόμενου ρεύματος. Η διαδικασία της φωτοσύνθεσης ελέγχεται μέσω της ποσότητας του ανηγμένου τεχνητού μεταφορέα ηλεκτρονίων, ο οποίος παράγεται κατά τον φωτισμό του φωτοσυνθετικού υλικού. Η οξείδωση του παραπάνω μεταφορέα στο ηλεκτρόδιο παράγει και το καταγραφόμενο σήμα, συσχετίζοντας έτσι την ένταση του ρεύματος με τη συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου. Το συγκεκριμένο σύστημα, χρησιμοποιώντας θυλακοειδείς μεμβράνες, έχει χρόνο ζωής έως και 23 ώρες και επιτρέπει την ανίχνευση των φωτοσυνθετικών ζιζανιοκτόνων με όριο ανίχνευσης της τάξεως των 10-300nM, αναλόγως με τον τύπο ζιζανιοκτόνου. Προκαταρτικές αναλύσεις δειγματοληψιών ύδατος ποταμού έδειξαν καλό συσχετισμό μεταξύ των αποτελεσμάτων που λήφθηκαν με χρωματογραφία-GC και τη χρήση του παραπάνω βιοαισθητήρα. Παράλληλα μελετήθηκε η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων Chlamydomonas, όπου και παρατηρήθηκε αύξηση του χρόνου ζωής σε 42 ώρες και μείωση του ορίου ανίχνευσης των φωτοσυνθετικών ζιζανιοκτόνων στα 20-8nM, ανάλογα με τον τύπο ζιζανιοκτόνου.