Μελέτη φυτοχημικού περιεχομένου και βιοδραστικότητας ελληνικών ψυχανθών

Abstract

Main objective of the thesis is the evaluation of Greek legumes belonging to Fabaceae family through the determination of their content in bioactive molecules, with special focus on phytoestrogens. In this context, 6 plants collected from the wild Greek biodiversity, 2 widely cultivated plants and 14 novel-improved cultivated varieties were studied. Additionally, the seeds of 16 cultivated and novel-improved legume species were also evaluated. In specific, the qualitative and quantitative content of fatty acids, carotenoids and phytoestrogens-phenolic compounds was determined in plants and seeds extracts obtained with solvents of different polarities. To achieve this goal, their total phenolic and tannin contents were assessed using a newly developed, improved, modified micromethod version of the classical methods, while their total carotenoid content was measured using the literature procedure. Additionally, the derivatization and quantification method of 34 fatty acids with GC-MS technique was also modified improved and used for the evaluation of their presence in samples studied. In the terms of thesis implementation, a novel method was developed, validated and applied allowing the quantitative determination of 67 phenolic phytoestrogens presence in only 35 minutes using the LC-MS/MS technique. This novel method surpasses those in use todate in speed, accuracy and number of determined analytes, since the best currently in use method allows the simultaneous determination of only 16 molecules. Moreover, a mass spectrometry library was constructed for the qualitative detection of 74 phenolic phytoestrogens among with a 22 min-liquid chromatographic method. Finally, a novel method was developed, evaluated and applied for the simultaneous quantification of 9 bioactive carotenoids based on the combined use of LC-MS/MS and HPLC-DAD techniques. The bioactivity of the extracts was evaluated through the assessment of their antioxidant capacity using the DPPH and FRAP assays and the measurement of their activity against the paracites Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis, which constitute worldwide the two most ubiquitous nematodes among small ruminants. Results herein indicate that most of the studied Greek legumes except for rich source of proteins, constitute an important source of health beneficial fatty acids and natural molecules with high antioxidant activity. Consequently, their fruits-seeds and plant tissues display a remarkable potential for incorporation into the diet of humans (fruits-seeds) and productive animals (plant tissues). In particular, T. repens was determined to possess a particularly rich content of phenolic antioxidants and carotenoids, a high concentration of tannins and a strong activity against the parasites Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis and the resistant eggs of the latter. Additionally, the species studied B. bituminosa, L. laxiflorus, T. physodes, C. incicum, C. arientitum as well as many of the improved plants studied in the thesis were also determined to contain significant amounts of bioactive secondary metabolites with high antioxidant and antiparasitic activities.

Αντικείμενο της διατριβής είναι η αξιολόγηση των Ελληνικών ψυχανθών που εντάσσονται στην οικογένεια Fabaceae μέσω της μελέτης του περιεχομένου τους σε βιοδραστικά μόρια, με έμφαση τα φυτοοιστρογόνα. Συγκεκριμένα, στο πλαίσιο της υλοποίησής της μελετήθηκαν 6 φυτά που συλλέχθηκαν από την άγρια Ελληνική βιοποικιλότητα, 2 ευρέως καλλιεργούμενα φυτά και 14 νέες-βελτιωμένες ποικιλίες καλλιεργούμενων φυτών. Παράλληλα, αξιολογήθηκαν και 16 σπέρματα καλλιεργούμενων και βελτιωμένων ψυχανθών. Αναλυτικότερα, στα εκχυλίσματα των φυτών και σπερμάτων -με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας- προσδιορίστηκε η ποιοτική και ποσοτική περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα, καροτενοειδή και φυτοοιστρογόνα-φαινολικές ενώσεις. Για την επίτευξη του στόχου αυτού πραγματοποιήθηκε βελτίωση και μετατροπή σε μικρομέθοδο των κλασσικών μεθόδων προσδιορισμού των ολικών φαινολικών και ταννινών, ενώ προσδιορίστηκε και το συνολικό τους περιεχόμενο σε καροτενοειδή. Επιπλέον, τροποποιήθηκε η μέθοδος παραγωγοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού 34 λιπαρών οξέων με την τεχνική GC-FID. Στο πλαίσιο διενέργειας της διατριβής αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και εφαρμόστηκε μια νέα μέθοδος που επιτρέπει τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των 67 κοινότερων βιοδραστικών φαινολικών φυτοοιστρογόνων, σε μόλις 35 λεπτά με την τεχνική LC-MS/MS. Η νέα μέθοδος υπερτερεί των χρησιμοποιούμενων έως τώρα σε ταχύτητα, ακρίβεια και αριθμό προσδιοριζόμενων μορίων, αφού η βέλτιστη των εν χρήσει μεθόδων επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μόνο 16 αναλυτών-μορίων. Παράλληλα, κατασκευάστηκε βιβλιοθήκη φασμάτων μάζας για την ποιοτική ανίχνευση της παρουσίας 74 φαινολικών φυτοοιστρογόνων σε συνδυασμό με χρωματογραφική μέθοδο 22 λεπτών. Τέλος, αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και εφαρμόστηκε μία νέα μέθοδος για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό 9 βιοδραστικών καροτενοειδών που βασίζεται στον συνδυασμό της χρήσης των τεχνικών LC-MS/MS και HPLC-DAD. Η βιοδραστικότητα των εκχυλισμάτων αξιολογήθηκε μέσω του προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας με τη χρήση των μεθόδων DPPH και FRAP και της μέτρησης της δραστικότητάς τους έναντι των παρασίτων Haemonchus contortus και Trichostrongylus colubriformis, που αποτελούν παγκοσμίως τα νηματώδη παράσιτα που προσβάλλουν συχνότερα τα μικρά μηρυκαστικά. Τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν ότι η πλειονότητα των Ελληνικών ψυχανθών που μελετήθηκαν, εκτός από πλούσια πηγή πρωτεϊνών, αποτελεί σημαντική πηγή ωφέλιμων για την υγεία λιπαρών οξέων και φυσικών μορίων με υψηλή αντιοξειδωτική δράση. Ως επακόλουθο, τα σπέρματα και οι φυτικοί τους ιστοί διαθέτουν αξιοσημείωτες δυνατότητες για ενσωμάτωση στη διατροφή των ανθρώπων (σπέρματα) και παραγωγικών ζώων (υπόλοιπο φυτό). Ειδικότερα, το T. repens προσδιορίστηκε ότι εμπεριέχει ένα ιδιαίτερα πλούσιο περιεχόμενο σε φαινολικά αντιοξειδωτικά και καροτενοειδή, έχει υψηλή συγκέντρωση ταννινών και ισχυρή δράση έναντι των παρασίτων Haemonchus contortus και Trichostrongylus colubriformis και των ανθεκτικών αβγών του δεύτερου. Επίσης, τα είδη B. bituminosa, L. laxiflorus, T. physodes, C. incicum, C. arientitum και πολλά από τα βελτιωμένα φυτά που μελετήθηκαν στη διατριβή προσδιορίστηκε ότι επίσης εμπεριέχουν σημαντικές ποσότητες βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών με υψηλή αντιοξειδωτική και αντιπαρασιτική δράση.