Συσχέτιση των βιολογικών και κλινικών χαρακτηριστικών των πολυμορφισμών Asn/Ser, Asn/Asn, Ser/Ser του γονιδίου του υποδοχέα FSH καθώς και των πολυμορφισμών PvuII και RsaI των γονιδίων ESR1 και ESR2 των οιστρογονικών υποδοχέων ERα και ERβ στην εξωσωματική γονιμοποίηση

Abstract

Ovarian stimulation in Assisted Reproduction Techniques (ART) poses a question mark, especially during the first stimulation treatment. Several parameters like age, endocrine parameters (basal FSH, AMH, Inhibin B) and ultrasound parameters (antral follicular count) can be used to predict the ovarian reserve, with different sensitivity. Currently, no markers exist to guide clinicians in FSH starting dose selection, in ART protocols. This is based solely in clinician experience. The quantity of FSH used is arbitrary, which may lead either to low-dose and thus non-effective treatment, either to over-dose treatment with great risk for the appearance of ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS). In order to be able to use reliable markers for the prediction of the ovarian response to controlled ovarian stimulation (COS), the research turned into the use of genetic markers and Pharmacogenetics. The ultimate goal of the field of Pharmacogenetics, combining the knowledge from pharmacology and genetics, is to optimize the administration of drugs, increase their efficacy and predict or even minimize their undesirable effects. In order to broaden the area of interest and to describe the important role of the whole genome on drug response, the term Pharmacogenomics has been issued. Pharmacogenomics covers the stydy of the genome and its products that are related to drug response (mRNA, proteins). By obtaining this knowledge, it will be possible to lead to the development of diagnostic tests to predict the efficacy and safety of a number of drugs, in order to achieve individualization of drug administration in patients. After 2000, when Perez-Mayorga presented evidence for the association of FSH receptor genotype with ovarian response to FSH in women undergoing controlled ovarian stimulation, the bibliography is rich in attempting to establish whether it exists an interaction between the genetic variability of FSH receptor and the exogenous use of FSH, the basal FSH levels, the ovarian response or the pregnancy rates. Concerning the oestrogen receptors, several studies have claimed that certain oestrogen receptor alpha gene (ESR1) polymorphisms may be involved in COS outcome and infertility. Moreover, there exist investigations on new polymorphisms concerning oestrogen receptor beta gene (ESR2). Heterogeneity of the results observed may be explained by the different ethnic populations involved and the design of the studies. Previous studies in humans concluded that a multigenic model including specific FSHR, ESR1 and ESR2 genotype patterns may partially explain the poor response to FSH. These polymorphisms seem to play a great part in determining the ovarian response in controlled ovarian stimulation during assisted reproduction techniques, considering women with normal ovarian function. These genetic alterations are a fine example when trying to relate genetic changes with the endocrine regulation of reproduction. The aim of our study is to analyse three different polymorphisms, PvuII (T/C) polymorphism in ESR1 gene, RsaI (G/A) polymorphism in ESR2 gene and Ser680Asn polymorphism in FSH receptor gene, in a Greek population and their involvement in ovarian stimulation outcome and pregnancy rates. A total of 109 normally ovulating female patients underwent IVF or ICSI. The genotyping for the three polymorphisms was performed with real-time polymerase chain reaction. Each locus was studied alone, and in combination with the others. The study focused in the associations of gene polymorphisms with COS and pregnancy outcome of IVF/ICSI, and in the associations of gene polymorphisms combinations with COS and pregnancy outcome of IVF/ICSI. Studying each locus alone, no significant results were drawn for ESR1 and ESR2 genes. Concerning the FSHR gene polymorphism, the women carrying the Asn/Asn variant presented higher total amount of gonadotrophins used (P=0.048) and tended to have higher number of stimulation days (P=0.057). Considering the ESR1 and FSHR gene polymorphisms in combination, the TC/SA combination presents the highest number of pregnancies in poor responders group (3/4 patients with pregnancy carried this genotype), in good responders group (4/12 patients with pregnancy carried this genotype) and in the total population (10/26 patients with pregnancy carried this genotype). All other genotype combinations presented incidence of pregnancy, except the CC/AA combination. The CC/AA genotype presents the worst profile of ovulation induction, confirming a poor responder profile: the total amount of gonadotrophins used was highest in CC/AA group (P<0.05). The peak E2, the number of follicles and of retrieved oocytes and the pregnancy rate were significantly lower (P<0.05). This genotype combination seems to be over-presented in the poor responders group in a statistically significant way (P=0.038). Women with CC/AA combination have 1.5- 2.4 times more risk to be poor responders in comparison with women that do not carry that combination. This study supports the hypothesis that an oligogenic model including the well studied ESR1 and FSHR genes is involved in the controlled ovarian stimulation outcome indicating that the CC/AA genotype presents the worst ovulation induction profile, while the TC/SA genotype presents the higher number of pregnancies in this population. This observation opens a new avenue for investigation of the genetic profile of patients that present many failures in previous IVF/ICSI attempts and support the choice of appropriate regimes for ovarian stimulation before enrolled in an IVF/ICSI procedure, depending on genetic markers The selection and combination of the appropriate genetic markers will lead in a better prediction of the ovarian response to stimulation and of pregnancy.

Η διέγερση των ωοθηκών κατά την Υποβοηθούμενη Αναπαραγωγή (ΥΑ) θέτει ορισμένα ερωτήματα, ιδιαίτερα σε ότι αφορά την πρώτη θεραπευτική προσπάθεια ωοθηκικής διέγερσης. Αρκετές παράμετροι όπως η ηλικία, ενδοκρινικές παράμετροι (βασική τιμή FSH, AMH, Ινχιμπίνη Β) και υπερηχογραφικές παράμετροι (μέτρηση ωοθυλακίων με άντρο-antral follicular count) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της ωοθηκικής εφεδρείας, με διαφορετική ευαισθησία. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν δείκτες οι οποίοι να μπορούν να καθοδηγήσουν τους κλινικούς ιατρούς στην επιλογή της δόσης έναρξης της χορηγούμενης FSH, στα θεραπευτικά πρωτόκολλα υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Ο καθορισμός της δόσης βασίζεται μόνο την κλινική εμπειρία. Η ποσότητα της χορηγούμενης FSH είναι αυθαίρετη, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει είτε σε χαμηλή δόση και επομένως μη αποτελεσματική θεραπεία, είτε σε υπερβολική δόση με κίνδυνο εμφάνισης του συνδρόμου ωοθηκικής υπερδιέγερσης (ovarian hyperstimulation syndrome-OHSS). Αποσκοπώντας στη χρήση αξιόπιστων δεικτών για την πρόβλεψη της ωοθηκικής απάντησης στην ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση (controlled ovarian stimulationCOS), η έρευνα στράφηκε στη χρήση των γενετικών δεικτών και της Φαρμακογενετικής. Ο απώτερος στόχος του πεδίου της Φαρμακογενετικής, συνδυάζοντας τη γνώση από τη φαρμακολογία και τη γενετική, είναι να βελτιστοποιήσει την χορήγηση των φαρμάκων, να αυξήσει την αποτελεσματικότητά τους και να προβλέψει ή ακόμα να περιορίσει τις ανεπιθύμητες ενέργειές τους. Προκειμένου να διευρυνθεί το πεδίο του ενδιαφέροντος και να περιγραφεί ο σπουδαίος ρόλος του συνόλου του γονιδιώματος στην απάντηση στη φαρμακοθεραπεία, εισήχθει ο όρος Φαρμακογενωμική. Η Φαρμακογενωμική περιλαμβάνει τη μελέτη του γονιδιώματος και των παραγώγων του (mRNA, πρωτείνες) σε σχέση με την ανταπόκριση του ατόμου σε φαρμακευτικές ουσίες. Διαθέτοντας αυτή τη γνώση, θα είναι δυνατό να αναπτυχθούν διαγνωστικές δοκιμασίες για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας και της ασφάλειας φαρμάκων με σκοπό την εξατομίκευση της φαρμακευτικής αγωγής σε ασθενείς. Μετά το 2000, όταν ο Perez-Mayorga παρουσίασε στοιχεία για τον συσχετισμό του γονότυπου του υποδοχέα της FSH (FSHR) με την ωοθηκική απάντηση στη διέγερση με FSH των γυναικών που υποβάλλονται σε ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση, η βιβλιογραφία είναι πλούσια σε προσπάθεια να αποδείξει εάν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ της γενετικής ποικιλότητας στον υποδοχέα της FSH και στην εξωγενή χορήγηση FSH, στη βασική τιμή FSH, στην απάντηση των ωοθηκών ή στα ποσοστά κύησης. Σε ότι αφορά στους οιστρογονικούς υποδοχείς, πολλές μελέτες ισχυρίστηκαν ότι ορισμένοι πολυμορφισμοί στο γονίδιο του οιστρογονικού υποδοχέα άλφα-ΕRα (ESR1) μπορεί να εμπλέκονται στη έκβαση της ελεγχόμενης ωοθηκικής διέγερσης και στην υπογονιμότητα. Επιπλέον, υπάρχουν έρευνες για νέους πολυμορφισμούς που αφορούν στο γονίδιο του οιστρογονικού υποδοχέα βήτα-ΕRβ (ESR2). Η ετερογένεια στα παρατηρούμενα αποτελέσματα μπορεί να εξηγηθεί λαμβάνοντας υπόψη τη μελέτη πληθυσμών διαφορετικών εθνικοτήτων και το διαφορετικό σχεδιασμό των εκάστοτε μελετών. Προηγούμενες μελέτες στο ανθρώπινο είδος κατέληξαν ότι ένα πολυγονιδιακό μοντέλο που περιλαμβάνει συγκεκριμένους γονοτύπους των γονιδίων FSHR, ESR1 και ESR2 μπορεί να εξηγήσει μερικώς την πτωχή απάντηση στην FSH. Οι πολυμορφισμοί σε αυτά τα γονίδια φαίνεται να διαδραματίζουν ρόλο στον καθορισμό της απάντησης των ωοθηκών στην ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση κατά την υποβοηθούμενη αναπαραγωγή, σε γυναίκες με φυσιολογική λειτουργία των ωοθηκών. Αυτές οι γενετικές διαφοροποιήσεις αποτελούν εξαιρετικό παράδειγμα στην προσπάθεια συσχετισμού των μεταβολών σε γενετικό επίπεδο με την ενδοκρινική ρύθμιση της αναπαραγωγής. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να αναλύσει τρεις διαφορετικούς γονιδιακούς πολυμορφισμούς- τους πολυμορφισμούς PvuII (T/C) του γονιδίου ESR1, RsaI (G/A) του γονιδίου ESR2 και Ser680Asn του γονιδίου FSHR- σε ελληνικό πληθυσμό και τη συμμετοχή τους στην έκβαση της διέγερσης των ωοθηκών και στα ποσοστά των κυήσεων. Συνολικά, 109 γυναίκες με φυσιολογική ωορρηξία υποβλήθηκαν σε IVF ή ICSI. Η γονοτύπηση για τους τρεις πολυμορφισμούς πραγματοποιήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Κάθε γονιδιακός τόπος μελετήθηκε ξεχωριστά, και σε συνδυασμό με τους υπόλοιπους. Η μελέτη επικεντρώθηκε στους συσχετισμούς των γονιδιακών πολυμορφισμών με την έκβαση της ελεγχόμενης διέγερσης των ωοθηκών (COS outcome) και τα ποσοστά των κυήσεων σε IVF/ICSI, και στους συσχετισμούς των συνδυασμένων γονιδιακών πολυμορφισμών με την έκβαση της ελεγχόμενης διέγερσης των ωοθηκών (COS outcome) και τα ποσοστά των κυήσεων σε IVF/ICSI. Μελετώντας κάθε γονιδιακό τόπο ξεχωριστά, δεν εξάγονται στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα για τα γονίδια ESR1 και ESR2. Σε ότι αφορά τον πολυμορφισμό στο γονίδιο FSHR, οι ασθενείς που φέρουν τον γονότυπο Asn/Asn παρουσίασαν αυξημένο συνολικό αριθμό μονάδων γοναδοτροπινών που χρησιμοποιήθηκαν για διέγερση (Ρ=0.048) και έτειναν να έχουν υψηλότερο αριθμό ημερών διέγερσης (Ρ=0.057). Μελετώντας τον συνδυασμένο γονότυπο για τους πολυμορφισμούς των γονιδίων ESR1 και FSHR, ο γονοτυπικός συνδυασμός TC/SA παρουσιάζει τον υψηλότερο αριθμό σε κυήσεις στην ομάδα των πτωχών απαντητριών (3/4 ασθενείς με κύηση φέρουν αυτόν τον γονοτυπικό συνδυασμό), στην ομάδα των καλών απαντητριών (4/12 ασθενείς με κύηση φέρουν αυτόν τον γονοτυπικό συνδυασμό) και στο σύνολο του πληθυσμού μελέτης (10/26 ασθενείς με κύηση φέρουν αυτόν τον γονοτυπικό συνδυασμό). Όλοι οι γονοτυπικοί συνδυασμοί παρουσίασαν επίπτωση θετικής κλινικής κύησης στο σύνολο του πληθυσμού μελέτης, εκτός από τον γονοτυπικό συνδυασμό CC/AA. Ο γονότυπος CC/AA παρουσιάζει το χειρότερο προφίλ πρόκλησης ωοθυλακιορρηξίας, επιβεβαιώνοντας ένα προφίλ «πτωχής απάντησης»: ο συνολικός αριθμός μονάδων γοναδοτροπινών που χρησιμοποιήθηκαν για διέγερση ήταν υψηλότερος στην ομάδα CC/AA (Ρ<0.05). Η τιμή της οιστραδιόλης την ημέρα χορηγήσεως της hCG, ο αριθμός των ωοθυλακίων και των ωαρίων που ελήφθησαν καθώς και τα ποσοστά κύησης ήταν σημαντικά χαμηλότερα (Ρ<0.05). Αυτός ο γονοτυπικός συνδυασμός φαίνεται πως υπερεκφράζεται στην ομάδα των πτωχών απαντητριών με τρόπο στατιστικά σημαντικό (Ρ<0.38). Οι γυναίκες που φέρουν το γονοτυπικό συνδυασμό CC/AA έχουν 1.5-2.4 φορές περισσότερο κίνδυνο να είναι πτωχές απαντήτριες σε σχέση με τις γυναίκες που δε φέρουν αυτό το συνδυασμό. Αυτή η μελέτη υποστηρίζει την υπόθεση ότι ένα ολιγογονιδιακό μοντέλο που περιλαμβάνει τα εκτενώς μελετημένα γονίδια ESR1 και FSHR εμπλέκεται στην έκβαση της ελεγχόμενης διέγερσης των ωοθηκών, υποδεικνύοντας τον γονοτυπικό συνδυασμό CC/AA ως τον συνδυασμό με το χειρότερο προφίλ πρόκλησης ωοθυλακιορρηξίας, ενώ ο γονοτυπικός συνδυασμός TC/SA παρουσιάζει τον υψηλότερο αριθμό κυήσεων στον μελετώμενο πληθυσμό. Αυτή η παρατήρηση ανοίγει νέες οδούς στην έρευνα του γονιδιακού προφίλ των ασθενών που παρουσιάζουν πολλαπλές αποτυχίες σε προηγούμενες προσπάθειες IVF/ICSI και υποστηρίζει την επιλογή των κατάλληλων πρωτοκόλλων διέγερσης ωοθηκών πριν την διαδικασία IVF/ICSI, ανάλογα με τους γενετικούς δείκτες. Η επιλογή και ο συνδυασμός των κατάλληλων γενετικών δεικτών θα οδηγήσει σε καλύτερη πρόβλεψη της ωοθηκικής απάντησης στη διέγερση και της κύησης.