Destruction of gram - negative bacteria by lysozyme

Abstract

Gram-negative bacteria are the most economically significant spoilage agents of meat, fish and poultry and a number of species are also important causes of food-borne disease. Procedures for decontaminating foods are, therefore, of potential value, but such procedures must not alter the flavour of food, leave harmful residues or be prohibitively expensive. Lysozyme lyses Gram-positive bacteria and is readily obtainable at low cost from egg white, which is suitable for use in food processing. However, Gram-negative bacteria are lysozyme-resistant due to the presence of the lipid outer membrane of the cell wall, which prevents lysozyme from reaching its substrate (peptidoglycan). Also, current methods for modifying the outer membrane, to allow access of lysozyme, use toxic chemicals or extreme physical conditions and are not applicable to food treatment.

This thesis considers the possibility of modifying the outer membrane using osmotic shock, and developing lysozyme / osmotic shock killing procedures which are applicable to food treatment. In initial experiments, factors affecting the plasmolysis and deplasmolysis of Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens and Salmonella typhimurium cells in hypertonic media were investigated. At 20 to 370C, lysozyme caused little loss of cell viability during deplasmolysis though it markedly enhanced cell death when deplasmolysed cells were transferred to hypotonic diluents. Optimal conditions for cell death were determined following investigation of the effects on cell viability of: the water activity (aw) and nutrient composition of the plasmolysing medium; the nature of the aw-controlling solute; the nutrient composition of the hypotonic diluent; the role of osmoprotectants; the time of incubation in hypo- and hyper-osmotic media; and the concentration of lysozyme. Reductions in viability of up to 99.99% were observed when cells incubated for < 10 min in a hypertonic nutrient-rich medium were diluted in hypotonic medium containing 10 μg ml-1 lysozyme. However, the conditions required for optimal cell killing were dependent upon the test organism used.

Large reductions in viability (up to 99.999%) were also observed when cells subjected to a cold-shock in hyper-osmotic media at 0 to 10 0C were subsequently transferred to hypo-osmotic media containing lysozyme. In these experiments deplasmolysis and the presence of organic nutrients in the hypertonic media were not required to achieve high cell kills. Also, optimal conditions for cell killing were less dependent upon the test organism used.

The high (20 to 37 0C) and low (0 to 10 0C) temperature procedures developed were tested by their ability to decontaminate red meat and poultry skin artificially contaminated with S. typhimurium. In both cases a reduction in attached viable cells of > 90% was achieved, suggesting that the techniques might be applied commercially; however, cell kills were not as high as those observed for cells in suspension, indicating that attachment to a solid surface may confer some protection. Large reductions in the number of organisms recovered in washing solutions were also observed in these experiments. Thus, the procedures developed might additionally reduce cross-contamination of carcasses during slaughterhouse processes.

Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια είναι οι πιο σημαντικοί σηπτικοί παράγοντες του κρέατος, των ψαριών και των πουλερικών, ενώ κάποια από τα είδη αυτά είναι και σημαντικοί αιτιολογικοί παράγοντες τροφιμογενών νοσημάτων. Εξαιτίας των παραπάνω, διαδικασίες που επιτρέπουν την εξυγίανση των τροφίμων μπορεί να έχουν πρακτική αξία, υπό τον όρο ότι δεν αλλοιώνουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων, δεν ευθύνονται για επικίνδυνα κατάλοιπα, ενώ και το κόστος εφαρμογής τους δεν είναι απαγορευτικά υψηλό. Η λυσοζύμη λύνει τα θετικά κατά Gram βακτήρια και παράγεται με χαμηλό κόστος από το λεύκωμα των αβγών ενώ, επιπλέον, είναι συστατικό που είναι κατάλληλο για την επεξεργασία τροφίμων. Παρόλα αυτά, τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια είναι ανθεκτικά στη λυσοζύμη εξαιτίας της παρουσίας της λιπώδους εξωτερικής μεμβράνης στο κυτταρικό τους τοίχωμα, η οποία και παρεμποδίζει την πρόσβαση της λυσοζύμης στο ευαίσθητο σε αυτήν υπόστρωμα, τη πεπτιδογλυκάνη. Επιπλέον, οι σύγχρονες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη τροποποίηση της εξωτερικής μεμβράνης, έτσι ώστε να επιτρέπεται η δίοδος της λυζοζύμης στη πεπτιδογλυκάνη, βασίζονται στη χρήση τοξικών χημικών ουσιών ή ακραίων φυσικών συνθηκών κι ως εκ τούτου είναι ακατάλληλες για την επεξεργασία τροφίμων.

Η εργασία αυτή εξετάζει τη δυνατότητα τροποποίησης της διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων χρησιμοποιώντας οσμωτικά σοκ, με σκοπό να προσδιοριστούν οσμωτικές διαδικασίες πρόκλησης κυτταρικού θανάτου παρουσία λυσοζύμης που θα μπορούσαν να βρουν εφαρμογή στην επεξεργασία τροφίμων. Στα αρχικά πειράματα διερευνήθηκαν παράγοντες που επηρεάζουν τη πλασμόλυση και αποπλασμόλυση κυττάρων των Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens και Salmonella typhimurium σε υπέρτονα διαλύματα. Από τους 20 έως και τους 370C και, κατά τη διάρκεια της αποπλασμόλυσης, προκλήθηκε ελάχιστη μείωση της ζωτικότητας των κυττάρων από τη λυσοζύμη. Αντίθετα όταν, κύτταρα σε κατάσταση αποπλασμόλυσης, τοποθετήθηκαν σε υποτονικά διαλύματα, τα ποσοστά του κυτταρικού θανάτου αυξήθηκαν εντυπωσιακά. Με βάση αυτή τη παρατήρηση, προσδιορίστηκαν οι ιδανικές συνθήκες μεγιστοποίησης των ποσοστών του κυτταρικού θανάτου, διερευνώντας παράγοντες όπως (α) η ενεργότητα ύδατος (aw) και η σύνθεση του υπερτονικού διαλύματος, (β) η φύση του διαλύτη, (γ) η σύνθεση του υποτονικού διαλύματος, (δ) ο ρόλος των οσμο-προφυλακτικών ουσιών, (ε) οι χρόνοι επώασης στα υπο-και υπερτονικά διαλύματα, και (στ) η συγκέντρωση (δοσολογία) της λυσοζύμης. Η κυτταρική ζωτικότητα μειώθηκε κατά 4 log10 όταν κύτταρα που επωάστηκαν για λιγότερο από 10 min σε υπερτονικά διαλύματα μεταφέρθηκαν σε υποτονικό υπόστρωμα που περιείχε λυσοζύμη σε συγκέντρωση μέχρι 10 μg/ml. Οι βέλτιστες συνθήκες κυτταρικού θανάτου που απαιτήθηκαν, πάντως, ποίκιλλαν ανάλογα με τον μικροοργανισμό.

Μεγάλες μειώσεις στη ζωτικότητα, έως 5 log10, παρατηρήθηκαν όταν κύτταρα που υποβλήθηκαν σε κρυο-σοκ στους 0 έως 100C σε υπερτονικά διαλύματα, στη συνέχεια μεταγγίστηκαν σε υποτονικά υποστρώματα με λυσοζύμη. Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων, δεν απαιτήθηκε αποπλασμόλυση των κυττάρων παρουσία οργανικών θρεπτικών ουσιών στα υπερτονικά διαλύματα προκειμένου να επιτευχθούν υψηλά ποσοστά κυτταρικού θανάτου. Επιπλέον, οι βέλτιστες συνθήκες κυτταρικού θανάτου ήταν λιγότερο εξαρτώμενες από το είδος του μικροοργανισμού.

Oι διαδικασίες που προσδιορίστηκαν τόσο για τις υψηλότερες (20 έως 370C) όσο για τις χαμηλότερες θερμοκρασίες (0 έως 100C) ελέγχθηκαν για την ικανότητά τους να χρησιμοποιηθούν για την εξυγίανση κόκκινου κρέατος αλλά και δέρματος πουλερικών που είχαν προηγουμένως ενοφθαλμιστεί με S. typhimurium. Και με τις δύο διαδικασίες επιτεύχθηκαν μειώσεις του κυτταρικού πληθυσμού των βακτηρίων που υπερέβαιναν το 90%, εύρημα που υποδηλώνει ότι οι τεχνικές αυτές θα μπορούσαν να βρουν εμπορική εφαρμογή στην εξυγίανση τροφίμων. Παρόλα αυτά, η μείωση δεν ήταν τόση όση στα υδατικά διαλύματα, εύρημα που υποδηλώνει ότι η σύνδεση των βακτηρίων με στερεή επιφάνεια μπορεί να τους προσδίδει προστασία. Μεγάλες μειώσεις παρατηρήθηκαν, επίσης, στον πληθυσμό των βακτηρίων που ανακτήθηκαν από τα διαλύματα «πλύσης» των τροφίμων. Από αυτό συνάγεται ότι οι διαδικασίες που προσδιορίστηκαν θα μπορούσαν, επιπλέον, να χρησιμοποιηθούν για τη μείωση της βακτηριακής επιμόλυνσης των σφαγίων στις σφαγειοτεχνικές εγκαταστάσεις κατά τις διεργασίες σφαγής.