Μελέτη της έκφρασης φλεγμονωδών και αναγεννητικών παραγόντων σε πειραματικό μοντέλο ισχαιμίας/επαναιμάτωσης ήπατος-ηπατεκτομής

Abstract

The term “I/R injury” describes the paradox of additional tissue injury caused by reperfusion, following a period of prolonged acute ischemia. Damage relates to the tissue involved and, as SIRS or MOFS, to distant organs (lungs, kidneys, gastrointestinal system, brain, cardiovascular system), which were not influenced directly by the ischemic episode. The clinical result of I/R injury, in a hepatectomy with Pringle’s manoeuvre or in liver transplantation, ranges from mild hepatic dysfunction to ALF, biliary stenosis and graft rejection. Hepatic disorder after I/R incorporates multiple and various cell types, molecular mediators and signaling mechanisms.Treatment includes the inhibition of those molecules or signaling pathways which are involved in the pathophysiology and promotion of I/R injury. Furthermore, treatment can be accomplished by enhancing host defence as well as cells’ repairing and regenerative ability. Numerous methods have been studied in this field including gene modification, use of drugs, antioxidants, antibodies versus cell adhesion molecules, therapies towards specific cytokines, and on purpose temperature decrease of the involved organ. Experimental models, utilised to cause and study POLF, constitute three categories: hepatectomy (total or partial), devascularisation (total or partial) and models which combine the first two categories. Pig is the preferred animal used, given that its size is proportional to humans’ one and there are no ethical, technical or financial issues emerging. Experiments in which POLF is developed, have shown that a hepatectomy of 80% stimulates strongly hepatic regeneration, while 85% causes liver failure and inability of regeneration.Our experimental model combines a prolonged period of I/R with simultaneous extended PHx to 70-80% (the right lateral lobe was fully preserved), so as POLF to develop in the remaining liver. Experiments showed that continuous hepatic ischemia for 2h was tolerable to pigs, whereas in the 3h threshold all pigs died due to massive hepatic necrosis. In the present protocol, we chose a liver ischemic period of 2.5h, based on pilot experiments which yielded that this specific time resulted in sufficient and potentially reversible hepatic injury. Pigs can hardly tolerate even short periods of total hepatic ischemia. Thus, it was necessary to redirect the PV blood via a portocaval by-pass, to avoid PV congestion. The two groups (POLF and sham) were compared haemodynamically, biochemically, pathologically, and concerning gene expression through blood sampling (before the surgical procedure, at the beginning of reperfusion and in specific time points thereafter, until all animals underwent euthanasia) and hepatic tissue sampling. Biochemical findings confirmed the development of POLF, which caused haemodynamic alterations in the studied group versus sham, such as decrease of MAP/CPP and increase of ICP/HR/PP. Likewise, histological evaluation of tissue samples in the POLF group, after the animals’ autopsy, supported the presence of ALF. Finally, the mRNA of inflammatory and regenerative factors, such as the genes IL-6, STAT-3 and E-selectin, demonstrated (in the POLF group) increased expression in a statistically significant level, compared to sham. The proposed model is reproducible, potentially reversible and it can function as a basis for the study of the pathophysiology of I/R and POLF, the proper management of clinical conditions where hepatic I/R is involved and the long-term development of therapeutic (or other) interventions regarding the combination, or not, of I/R and POLF.

Η βλάβη μετά I/R περιγράφει το παράδοξο φαινόμενο κατά το οποίο η ιστική επαναιμάτωση, μετά από παρατεταμένη οξεία ισχαιμία, προκαλεί περαιτέρω βλάβη τόσο στους εμπλεκόμενους ιστούς όσο και σε απομακρυσμένα όργανα (κυρίως τους πνεύμονες και ακολουθούν οι νεφροί, το γαστρεντερικό σύστημα, ο εγκέφαλος και το καρδιαγγειακό σύστημα) που δεν επηρεάσθηκαν άμεσα από το ισχαιμικό επεισόδιο. Οι απομακρυσμένες συνέπειες της I/R σχετίζονται με την ανάπτυξη του SIRS και του MOFS. Σε ηπατεκτομή με χειρισμό Pringle’s ή σε ηπατική μεταμόσχευση, το κλινικό αποτέλεσμα της βλάβης από I/R εκτείνεται από την ήπια ηπατική δυσλειτουργία έως την ALF, τη στένωση των χοληφόρων και την απόρριψη του μοσχεύματος. Η ηπατική βλάβη μετά I/R είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολυάριθμους και ποικίλους κυτταρικούς τύπους, μοριακούς διαμεσολαβητές και σηματοδοτικούς μηχανισμούς.Ως γενική αρχή, η αντιμετώπιση της βλάβης μετά I/R γίνεται αναστέλλοντας τη δράση των μορίων ή τις σηματοδοτικές οδούς που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία αυτής της νοσογόνου κατάστασης και την προάγουν, καθώς επίσης ενισχύοντας την άμυνα, τις επιδιορθωτικές και τις αναγεννητικές δυνατότητες του κυττάρου και κατ’ επέκταση του οργανισμού. Για τη μείωση, λοιπόν, των εν λόγω βλαβών έχει μελετηθεί μία πληθώρα μεθόδων και πρακτικών, μεταξύ των οποίων η τροποποίηση γονιδίων, η χρήση φαρμάκων, αντιοξειδωτικές ουσίες, αντισώματα έναντι μορίων προσκόλλησης, θεραπείες κατά των κυτοκινών, η IPC και η σκόπιμη μείωση της θερμοκρασίας του άμεσα εμπλεκόμενου οργάνου.Για την πρόκληση και τη μελέτη της POLF έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα χειρουργικά μοντέλα που ανήκουν σε τρεις κατηγορίες: ηπατεκτομή (ολική ή μερική), απαγγείωση (ολική ή μερική) και μοντέλα που συνδυάζουν τις δύο προηγούμενες κατηγορίες. Ο χοίρος είναι το προτιμώμενο ζώο, στην πλειοψηφία αυτών των μοντέλων, γιατί διαθέτει διαστάσεις συγκρίσιμες με εκείνες του ανθρώπου και δεν αντιμετωπίζει φραγμούς ηθικής, τεχνικής ή οικονομικής φύσεως. Πειράματα πρόκλησης POLF έδειξαν ότι η ηπατεκτομή έως και 80% αποτελεί ισχυρό ερέθισμα που ενεργοποιεί την ηπατική αναγέννηση, ενώ πέρα από το 85% παρατηρείται ηπατική ανεπάρκεια και αδυναμία αναγέννησης.Το πειραματικό μοντέλο της συγκεκριμένης διατριβής συνδυάζει τη σημαντικού βαθμού I/R με την ταυτόχρονη εκτεταμένη PHx κατά 70-80% (ο δεξιός πλάγιος λοβός διατηρήθηκε ακέραιος) ώστε να προκαλέσει POLF στο, μικρού μεγέθους, υπολειπόμενο ήπαρ. Πειράματα έχουν δείξει ότι η συνεχής ηπατική ισχαιμία για 2h είναι ανεκτή από τους χοίρους, ενώ όταν αυτή διαρκεί για 3h όλοι οι χοίροι αποβιώνουν λόγω μαζικής ηπατικής νέκρωσης. Στο παρόν πρωτόκολλο, οι 2.5h της ηπατικής ισχαιμίας επιλέχθηκαν βάσει πιλοτικών πειραμάτων που ανέδειξαν ότι ο συγκεκριμένος χρόνος ισχαιμίας επιφέρει επαρκή και δυνητικά αναστρέψιμη ηπατική βλάβη. Οι χοίροι δυσκολεύονται να ανεχθούν ακόμη και μικρές περιόδους ολικής ηπατικής ισχαιμίας. Γι’ αυτό κρίθηκε απαραίτητη η εφαρμογή τεχνικής, όπως η πυλαιο-κοιλική παράκαμψη, η οποία να αποτρέπει την πυλαία συμφόρηση. Μέσω της συλλογής δειγμάτων αίματος (πριν τη χειρουργική επέμβαση, στην έναρξη της επαναιμάτωσης και έκτοτε σε τακτά χρονικά διαστήματα έως την ευθανασία των ζώων) και ηπατικού ιστού συγκρίθηκαν οι δύο ομάδες (POLF και sham) σε αιμοδυναμικό, βιοχημικό, ιστολογικό και γονιδιακό επίπεδο. Τα βιοχημικά ευρήματα επιβεβαίωσαν την ανάπτυξη της POLF, η οποία προκάλεσε αιμοδυναμικές μεταβολές στη μελετώμενη ομάδα έναντι της sham, όπως πτώση των MAP/CPP και αύξηση των ICP/HR/PP. Ομοίως, η παθολογοανατομική αξιολόγηση των ηπατικών βιοψιών στην ομάδα POLF, μετά τη νεκροτομή των ζώων, υποστήριξε την παρουσία της ALF. Τέλος, το mRNA φλεγμονωδών και αναγεννητικών παραγόντων όπως τα γονίδια IL-6, STAT-3 και E-σελεκτίνη παρουσίασε στην ομάδα POLF έκφραση αυξημένη σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο συγκριτικά με την ομάδα sham. Το προτεινόμενο πειραματικό μοντέλο είναι αναπαραγώγιμο, δυνητικά αναστρέψιμο και μπορεί να αποτελέσει βάση για την περαιτέρω μελέτη της παθοφυσιολογίας των I/R και POLF, την αρτιότερη διαχείριση των κλινικών καταστάσεων όπου εμπλέκεται η ηπατική Ι/R και τον μελλοντικό καθορισμό θεραπευτικών ή άλλων παρεμβάσεων που αφορούν στο συνδυασμό ή μη των I/R και POLF.