Διερεύνηση της παραγωγής βιομεμβρανών και της παρουσίας του λοιμογόνου παράγοντα Τ3S (σύστημα εκκρίσεως τύπου ΙΙΙ) σε κλινικά στελέχη salmonella που απομονώθηκαν σε παιδιά

Abstract

Salmonellosis is the second most common cause of infection of the gastrenteric system and a serious cause of foodborne outbreaks. Salmonella Enterica belongs to the most common enteropathogenic bacteria worldwide, causing diseases varying from mild gastroenteritis to severe systemic infections. The type of disease is determined by the virulence characteristics of the involved Salmonella strain, as well as by the host defense mechanisms.Of particular concern is the increasing association of human infections with multidrug –resistant Salmonella strains. There undoubtedly many factors associated with the emergence of resistance. A significant percentage of clinical drug resistance and consequent therapeutic failure in Salmonella is known to be associated with the formation of biofilms.Another virulence factor is the type III secretion system (T3SS) encoded in the Salmonella pathogenicity island (SPIs) is considered a “quantum leap” in the evolution of Salmonella as a pathogen.|The purpose of the thesis was to investigate the presence of some virulence factors (biofilms, virulence genes) and to compare their antimicrobial resistance in association with their biofilm forms and the presence of the virulence genes.During a three year period (2006-2008) 194 Salmonella strains were collected from children with gastroenteritis, who were either hospitalized or who attended the outpatient clinic of the Pentelis Children’s Hospital. The isolation and serological identification was performed by conventional methods. The antimicrobial susceptibility was performed by means of determination of the minimum inhibitory concentration (MIC). The MIC determined using two methods a) the automatic VITEK 2 system (bioMerieux-France) and b) by the standard broth dilution method according to CLSI. Biofilm formation was detected by the use of silicone disk. The strains producing biofilms were further tested for their antimicrobial susceptibility using a modified broth macrodilution method. All strains were screened for the presence of virulence genes using a PCR assay. Subsequent electrophoretic analysis of PCR amplified samples was carried out. A statistical package SPSS was used.Of the 194 Salmonella Enterica isolates, 19 different serotypes were identified. S.Enteritidis was the predominant serotype. From the total of the strains 109 (56%) were positive for biofilm formation. The biofilm forms showed increased antimicrobial resistance. At least one virulence gene was present in all Salmonella strains. Statistical analysis showed that there was a significant association regarding the presence of the virulence genes. The ability to form biofilm was statistically independent of any of the six genes.The development of new consensus methods for the determination of the antimicrobial susceptibility of the biofilm forms and their association with the virulence genes seems to be a major research challenge.

Η σαλμονέλλωση είναι η δεύτερη πιο συχνή αιτία λοίμωξης του γαστρεντερικού συστήματος και μια σημαντική αιτία τροφιμογενούς επιδημίας ανά τον κόσμο. Η σαλμονέλλα μπορεί να προκαλέσει λοιμώξεις, από μια ήπια γαστρεντερίτιδα μέχρι συστηματικές λοιμώξεις. Το είδος της λοίμωξης εξαρτάται αφ ενός από τα χαρακτηριστικά παθογονικότητας του κάθε στελέχους σαλμονέλλας και αφετέρου από το είδος του ξενιστή.Μεγάλο ποσοστό των λοιμώξεων οφείλονται σε βακτήρια που ασκούν την λοιμογόνο δράση τους μέσω της δημιουργίας βιομεμβρανών και σχετίζονται με αυξημένη αντοχή στα αντιβιοτικά με αποτέλεσμα την αποτυχία της θεραπείας .Ένας άλλος δείκτης είναι το σύστημα έκκρισης τύπου ΙΙΙ (T3SS) που κωδικοποιεί γονίδια της νησίδας παθογονικότητας τα τύπου 1 (SPI-1).Σκοπός: της διατριβής ήταν ο έλεγχος των παραγόντων παθογονικότητας (βιομεμβράνες, χρωμοσωμικά γονίδια), στην διερεύνηση της αντοχής των στελεχών σε κοινά αντιβιοτικά, στην συσχέτιση των παραπάνω παραγόντων στα αντιβιοτικά και στην λοιμογόνο δράση τους.Κατά την διάρκεια μιας τριετίας (2006-2008) 194 στελέχη σαλμονέλλας συλλέχθηκαν από παιδιά ηλικίας 1-14 ετών. Τα δείγματα προέρχονταν από το Γενικό Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης. Τα παιδιά νοσηλεύτηκαν ή προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία με συμπτώματα γαστρεντερίτιδας. Η ταυτοποίηση των μικροβίων έγινε με κλασσικές μικροβιολογικές μεθόδους. Ο έλεγχος ευαισθησίας πραγματοποιήθηκε με δύο μεθόδους α) με το αυτοματοποιημένο σύστημα VITEK II (bioMerieux-France) και β) με την μέθοδο αραιώσεων σε ζωμό σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI. Η διερεύνηση της παραγωγής βιομεμβράνων έγινε με την χρήση δίσκων σιλικόνης Στην συνέχεια τα στελέχη που εμφάνιζαν βιομεμβράνη ελέγχονταν περαιτέρω ως προς την αντιμικροβιακή αντοχή τους, χρησιμοποιώντας τροποποιημένη την μέθοδο αραιώσεων. Για την παρουσία των 6 γονιδίων παθογονικότητας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της PCR για τα γονίδια στόχους, ακολουθουμένη από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%.Τα αποτελέσματα καταγράφτηκαν και έγινε στατιστική επεξεργασία. Συνοπτικά τα 194 στελέχη σαλμονέλλας που απομονώθηκαν άνηκαν σε 19 διαφορετικούς οροτύπους. Η Salmonella Εnteritidis ήταν ο κυρίαρχος ορότυπος. Παραγωγή βιομεμβρανών ανιχνεύτηκε σε 109 (56%) των στελεχών. Οι πλαγκτονικές μορφές ήταν πολύ πιο ευαίσθητες στα αντιβιοτικά συγκριτικά με τις μορφές που εμφάνιζαν βιομεμβράνες. Τουλάχιστον 1 γονίδιο ήταν παρών σε όλα τα στελέχη. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπήρχε ισχυρή συσχέτιση των γονιδίων μεταξύ τους. Η παραγωγή βιομεμβράνης ήταν στατιστικά ανεξάρτητη από οποιοδήποτε γονίδιο. Σημαντική είναι η έρευνα για ανάπτυξη νέων μεθόδων για τον προσδιορισμό της αντιμικροβιακής αντοχής των βιομεμβρανικών μορφών των μικροβίων και η συσχέτιση τους με τα γονίδια παθογονικότητας.