Διερεύνηση της συχνότητας παρουσίας και της δυνατότητας επιβίωσης των campylobacter spp. στο κρέας της αίγας και του προβάτου

Abstract

Campylobacter bacteria are Gram negative spirally-curved rods and are currently classified in 31 species and 11 subspecies. Campylobacter spp. are widely known as foodborne pathogens and the thermophilic species Campylobacter jejuni (C. jejuni) and C. coli are most frequently isolated from human patients. According to the European Food Safety Authority (EFSA) annual reports, campylobacteriosis continues to be the most commonly reported zoonosis in the European Union since 2005, whereas the number of confirmed campylobacteriosis cases in humans shows an increasing trend over the past five years.The prevalence of Campylobacter in sheep and products thereof has not been as extensively investigated as in other farm animals, albeit the genetic relatedness of Campylobacter strains isolated from sheep meat and offal and from human campylobacteriosis cases has been demonstrated. Data regarding the prevalence of Campylobacter spp. in goats and products thereof are scarce and, therefore, the epidemiological role of goat meat and offal in human campylobacteriosis remains currently obscure. Even though data regarding the presence of Campylobacter spp. in small ruminants in Greece are absent, meat and offal of small ruminant origin are key components of traditional Greek dishes, especially during Easter. Consequently, Campylobacter contamination of goat and sheep meat could emerge as an important Public Health issue for our country.The present study was designed in order to investigate: The prevalence of goat and sheep meat contamination with Campylobacter spp. The susceptibility of Campylobacter isolates towards antimicrobial agents that are critically important for public health. The survival of Campylobacter on lamb meat during refrigeration storage. The experimental part of this study was conducted in three stages.During the first stage, the prevalence, genotypic diversity and antimicrobial susceptibility of Campylobacter spp. in goat and sheep carcasses at slaughter was investigated:In total, 851 samples were collected (343 meat surfaces, 282 ileum contents, 226 liver surfaces) and 835 Campylobacter isolates were detected in 274 out of 343 carcasses (116 kids, 110 lambs, 63 goats and 54 sheep). The contamination rates per carcass category were 78.4% for kids, 94.5% for lambs, 63.5% for goats, and 72.2% for sheep. On average, 30.0% of the intestinal content samples and more than 70.0% of carcass and liver surfaces yielded the presence of campylobacters. Multiplex-PCR and RFLP analysis identified Campylobacter coli as the most prevalent species (76.2%) followed by Campylobacter jejuni (21.4%), albeit 2.4% of selected colonies yielded the concurrent presence of both these species. Macrorestriction profiling by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was applied in order to characterise a subset of isolates. SmaI-PFGE successfully clustered 222 strains in 82 pulsotypes indicating high diversity among the campylobacter isolates (67 pulsotypes among 174 C. coli isolates and 15 pulsotypes among 48 C. jejuni isolates). Multiple pulsotypes were simultaneously present on single carcasses in the majority of tested animals. PFGE provided data regarding the potential routes of meat and liver contamination. Antimicrobial susceptibility patterns of Campylobacter isolates (n=240), determined by disk diffusion method, revealed resistance to tetracycline (47.9%), streptomycin (22.9%) and ciprofloxacin along with nalidixic acid (18.3%). Isolates exhibited low resistance to erythromycin (2.5%) and were susceptible to gentamicin. During the second stage, the prevalence, genotypic diversity and antimicrobial susceptibility of Campylobacter spp. in goat kid and lamb carcasses at retail was investigated:A total of 200 samples consisting of 100 meat and 100 liver surface swabs were collected from 53 goat kid and 47 lamb carcasses at 23 retail markets in Northern Greece, and 125 Campylobacter isolates were recovered from 32 meat surfaces (32.0%) and 44 liver surfaces (44.0%). Multiplex-PCR and RFLP analysis specified C. coli as the most frequently detected species (59.2%) followed by C. jejuni (40.8%). PFGE was applied in order to typify a subset of isolates (n=80). SmaI-PFGE successfully clustered the 80 isolates in 38 SmaI-PFGE types indicating high heterogeneity among the analysed Campylobacter isolates and provided data regarding the dissemination of Campylobacter among carcasses stored in the same retail market. Antimicrobial susceptibility profiles of Campylobacter isolates, assessed by disk diffusion method, indicated that 31 isolates (24.8%) were multi-drug resistant and the most common profile was the concurrent resistance to tetracycline and streptomycin. Overall, 56.8% of isolates (n=71) exhibited resistance to at least one antimicrobial (tetracycline 34.4%, quinolones 27.2%, and streptomycin 20.8%). However, all isolates were susceptible to erythromycin and gentamicin.During the third stage, the survival of C. coli cells (culturable and viable but nonculturable-VBNC) on lamb meat during refrigeration storage was investigated:During the experiment, pieces of lamb meat were artificially inoculated with a defined C. coli population in the exponential growth phase and the viable campylobacters were enumerated during the storage of meat for one week under refrigeration (4°C). The enumeration of viable C. coli cells was performed with the classical culture method using two solid media (modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar, mCCDA, και Columbia Blood Agar, CBA) and with an optimized quantitative molecular method that discriminates viable from dead Campylobacter cells (viable-PCR, v-PCR) which was based on quantitative real-time PCR (q-PCR) combined with propidium monoazide (ΡΜΑ). The enumeration of the C. coli population was performed on three separate pieces of meat. During the refrigeration storage of the artificially inoculated lamb meat, a reduction of the viable C. coli population was observed in all three experiments according to all quantitative methods applied. However, the reduction rate of the viable C. coli cells differed in a method-dependent manner. In the three experiments, on average, the reduction of the viable C. coli population was 0,44 ± 0,03, 0,76 ± 0,06, and 2,89 ± 1,72 log bacterial cells per meat sample (25 cm2 surface), according to the optimized molecular method, the culture on CBA and the culture on mCCDA, respectively. Moreover, the average daily rate of the viable C. coli population reduction during meat storage was 0,06 ± 0,005, 0,11 ± 0,009, and 0,41 ± 0,245 log bacterial cells per meat sample (25 cm2 surface), according to the optimized molecular method, the culture on CBA and the culture on mCCDA, respectively.According to the results of the present study: The contamination of goat and sheep carcasses at slaughter with heterogeneous populations of thermophilic campylobacters was confirmed along with their potential input in the epidemiology of human campylobacteriosis. The contamination of retail lamb and goat kid carcasses with heterogeneous populations of thermophilic campylobacters was confirmed, a fact that demonstrates that goat kid and lamb meat and offal at retail could serve as vehicles for consumer contamination with Campylobacter. The detected 100% susceptibility to gentamicin as well as the low levels of resistance towards erythromycin and of multi-drug resistance exhibited by the Campylobacter isolates are positive findings for Public Health. The relatively high levels of resistance exhibited by the Campylobacter isolates towards the antimicrobial agents tetracycline, streptomycin and quinolones are indicative of the widespread use of the respective veterinary drugs in small ruminants at farm level in our country. The optimized molecular protocol of v-PCR with PMA, which was developed in the present study, quantifies the viable Campylobacter cells (culturable and viable but nonculturable-VBNC) rapidly (≈ 8 h) and by exhibiting a high specificity of detection and a wide range of quantification (2.6 x 102 - 5.2 x 108 cells/ml). The survival of C. coli on lamb meat during refrigeration storage was confirmed. The small reduction of the viable C. coli population until the time of meat spoilage, which renders it unsuitable for consumption, confirmed the likelihood of viable C. coli cells being disseminated by cross-contamination during the domestic meat refrigeration storage and the involving risk for consumer contamination.

Τα βακτήρια του γένους Campylobacter είναι Gram αρνητικοί βάκιλοι με σπειροειδώς κυρτό σχήμα και μέχρι στιγμής ταξινομούνται σε 31 είδη και 11 υποείδη. Τα Campylobacter spp. είναι ευρέως γνωστά ως τροφιμογενή παθογόνα του ανθρώπου και τα θερμόφιλα είδη Campylobacter jejuni (C. jejuni) και C. coli απομονώνονται συχνότερα από περιστατικά ασθενών. Σύμφωνα με τις ετήσιες εκθέσεις της Ευρωπαϊκής Αρχής για την Ασφάλεια των Τροφίμων (European Food Safety Authority, EFSA), η καμπυλοβακτηριδίαση αποτελεί σταθερά την πρώτη σε συχνότητα καταγεγραμμένη ζωανθρωπονόσο στην Ευρωπαϊκή Ένωση από το 2005, ενώ ο αριθμός των επιβεβαιωμένων περιστατικών καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου παρουσιάζει μια στατιστικά σημαντική αυξητική τάση κατά τα τελευταία πέντε χρόνια.Η συχνότητα μόλυνσης των προβάτων και των προϊόντων τους με Campylobacter δεν έχει μελετηθεί τόσο εκτενώς όπως σε άλλα παραγωγικά είδη ζώων, ωστόσο, έχει τεκμηριωθεί η ομοιότητα του γενετικού προφίλ μεταξύ στελεχών καμπυλοβακτηριδίων, τα οποία απομονώθηκαν από κρέας και εδώδιμα σπλάχνα προβάτων και ασθενείς με καμπυλοβακτηριδιακή εντερίτιδα. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τη συχνότητα παρουσίας των ειδών Campylobacter στις αίγες και τα προϊόντα τους είναι εξαιρετικά περιορισμένα, με αποτέλεσμα ο ρόλος του κρέατος και των εδώδιμων σπλάχνων των αιγών στην επιδημιολογία της καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου να παραμένει προς το παρόν αδιευκρίνιστος. Αν και δεν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα για την παρουσία των Campylobacter spp. στα μικρά μηρυκαστικά στην Ελλάδα, το κρέας και τα εδώδιμα σπλάχνα τους αποτελούν βασικά συστατικά παραδοσιακών ελληνικών γευμάτων, ιδιαίτερα κατά την περίοδο του Πάσχα. Κατά συνέπεια, η μόλυνση του κρέατος της αίγας και του προβάτου με Campylobacter θα μπορούσε να αναδειχθεί σε ένα σημαντικό ζήτημα Δημόσιας Υγείας για τη χώρα μας.Η παρούσα μελέτη σχσχεδιάστηκε με στόχο να διερευνηθούν: Η συχνότητα μόλυνσης του κρέατος της αίγας και του προβάτου με Campylobacter spp. Η ευαισθησία των απομονωθέντων στελεχών Campylobacter σε αντιμικροβιακούς παράγοντες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τη Δημόσια Υγεία. Η επιβίωση του Campylobacter σε κρέας αμνού κατά τη διάρκεια συντήρησης σε συνθήκες ψύξης.Το πειραματικό μέρος της διατριβής πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια.Στο πρώτο στάδιο διερευνήθηκε η συχνότητα παρουσίας, ο προσδιορισμός των γενοτυπικών διαφορών και η αντιμικροβιακή ευαισθησία των Campylobacter spp. σε σφάγια αιγών και προβάτων σε επίπεδο σφαγείου:Συνολικά, συλλέχθηκαν 851 δείγματα (343 από επιφάνειες κρέατος, 282 από εντερικά περιεχόμενα, 226 από επιφάνειες ήπατος) σε δύο βιομηχανικά σφαγεία της κεντρικής Μακεδονίας από τον Αύγουστο του 2007 μέχρι το Φεβρουάριο του 2009. Aνιχνεύθηκαν 835 στελέχη (isolates) Campylobacter σε 274 από τα 343 σφάγια που εξετάστηκαν (116 ερίφια, 110 αμνοί, 63 αίγες, και 54 πρόβατα). Τα επιμέρους ποσοστά μόλυνσης ανά κατηγορία ζώου ήταν 78,4% για τα ερίφια, 94,5% για τους αμνούς, 63,5% για τις αίγες, και 72,2% για τα πρόβατα. Κατά μέσο όρο, η παρουσία των καμπυλοβακτηριδίων ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 30,0% των εντερικών περιεχομένων και σε ποσοστό μεγαλύτερο από 70,0% των επιφανειών κρέατος και ήπατος. Η ανάλυση των απομονωθέντων στελεχών με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (multiplex PCR, m-PCR) και της ανάλυσης πολυμορφισμού του μήκους περιοριστικών θραυσμάτων (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) ταυτοποίησε το C. coli ως το συχνότερα απομονωμένο είδος (76,2%) ακολουθούμενο από το C. jejuni (21,4%) ενώ στο 2,4% των εξετασθέντων τυπικών αποικιών επιβεβαιώθηκε η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο ειδών. Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης σε παλλόμενο πεδίο (Pulsed Field GelElectrophoresis, PFGE) εφαρμόστηκε σε μια ομάδα των απομονωθέντων Campylobacter για τη γενετική τους τυποποίηση. Η μέθοδος SmaI-PFGE ομαδοποίησε επιτυχώς 222 στελέχη σε 82 παλσοτύπους υποδηλώνοντας μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των στελεχών. Πολλαπλοί παλσότυποι ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα στην επιφάνεια ενός σφαγίου στην πλειοψηφία των ζώων που εξετάστηκαν. Η PFGE παρείχε πληροφορίες σχετικά με τις πιθανές οδούς μόλυνσης των σφαγίων. Το προφίλ της αντιμικροβιακής ευαισθησίας των απομονωθέντων Campylobacter (n=240), όπως προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της διάχυσης με δίσκους, υποδήλωσε αντοχή στην τετρακυκλίνη (47,9%), τη στρεπτομυκίνη (22,9%) και τη σιπροφλοξακίνη μαζί με το ναλιδιξικό οξύ (18,3%). Παρατηρήθηκε χαμηλή αντοχή των εξετασθέτων στελεχών στην ερυθρομυκίνη (2,5%) και καθολική ευαισθησία στη γενταμικίνη.Στο δεύτερο στάδιο διερευνήθηκε η συχνότητα παρουσίας, ο προσδιορισμός των γενοτυπικών διαφορών και η αντιμικροβιακή ευαισθησία των Campylobacter spp. σε σφάγια εριφίων και αμνών σε επίπεδο λιανικής πώλησης κρέατος:Συνολικά, 200 δείγματα αποτελούμενα από 100 επιφάνειες κρέατος και 100 επιφάνειες ήπατος συλλέχθηκαν από 53 σφάγια εριφίων και 47 σφάγια αμνών σε 23 σημεία λιανικής πώλησης κρέατος στην ευρύτερη περιοχή της Θεσσαλονίκης κατά την περίοδο της Μεγάλης Εβδομάδας του 2009 και 2010 και απομονώθηκαν 125 στελέχη (isolates) Campylobacter από 36 επιφάνειες κρέατος (36,0%) και 44 επιφάνειες ήπατος (44,0%). Με τις μεθόδους m-PCR και RFLP ταυτοποιήθηκε το C. coli ως το συχνότερα απομονωμένο είδος (59,2%) ακολουθούμενο από το C. jejuni (40,8%). Η μέθοδος PFGE εφαρμόστηκε για τη γενοτυπική ανάλυση μιας ομάδας (n=80) απομονωθέντων στελεχών (isolates). H μέθοδος SmaI-PFGE ομαδοποίησε επιτυχώς τα 80 στελέχη σε 38 SmaI-PFGE γενοτύπους, υποδηλώνοντας μεγάλη ετερογένεια ανάμεσα στα στελέχη που εξετάστηκαν, και παρείχε πληροφορίες σχετικά με τη διασπορά του Campylobacter μεταξύ των σφαγίων που συντηρούνταν στο ίδιο κατάστημα λιανικής πώλησης κρέατος. Το προφίλ της αντιμικροβιακής ευαισθησίας των απομονωθέντων Campylobacter, όπως προσδιορίστηκε από τη μέθοδο της διάχυσης με δίσκους, υποδήλωσε ότι 31 στελέχη (24,8%) παρουσίασαν πολυαντοχή, και ότι συχνότερα παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αντοχή στην τετρακυκλίνη και τη στρεπτομυκίνη. Συνολικά, ποσοστό 56,8% των στελεχών (n=71) εμφάνισε αντοχή σε μία τουλάχιστον αντιμικροβιακή ουσία (τετρακυκλίνη 34,4%, κινολόνες 27,2%, και στρεπτομυκίνη 20,8%). Ωστόσο, όλα τα στελέχη Campylobacter που εξετάστηκαν ήταν ευαίσθητα στην ερυθρομυκίνη και τη γενταμικίνη.Στο τρίτο στάδιο διερευνήθηκε η ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων (καλλιεργήσιμων και βιώσιμων αλλά μη καλλιεργήσιμων-VBNC) του C. coli σε κρέας αμνού σε συνθήκες ψύξης:Κατά τη διάρκεια του πειραματισμού έγινε τεχνητός ενοφθαλμισμός τεμαχίων κρέατος αμνού με γνωστό πληθυσμό C. coli στην εκθετική φάση της ανάπτυξης και ποσοτικός προσδιορισμός των βιώσιμων καμπυλοβακτηριδίων κατά τη συντήρηση του κρέατος σε συνθήκες ψύξης (4°C) για μια εβδομάδα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των βιώσιμων κυττάρων του C. coli πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της κλασικής καλλιέργειας σε δύο στερεά υποστρώματα (modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar, mCCDA, και Columbia Blood Agar, CBA) και με μια βελτιστοποιημένη μοριακή δοκιμή ποσοτικού προσδιορισμού και διαχωρισμού των βιώσιμων από τα νεκρά καμπυλοβακτηρίδια (viable-PCR, v-PCR) που αναπτύχθηκε με βάση την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (quantitative real-time PCR, q-PCR) σε συνδυασμό με το μονοαζίδιο του προπιδίου (propidium monoazide, ΡΜΑ). Ο πειραματισμός επαναλήφθηκε τρεις φορές σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα και σε κάθε ημερήσιο έλεγχο του πληθυσμού του C. coli εξετάζονταν τρία ξεχωριστά τεμάχια κρέατος. Κατά τη συντήρηση του τεχνητά ενοφθαλμισμένου κρέατος αμνού σε συνθήκες ψύξης, παρατηρήθηκε μείωση του πληθυσμού των βιώσιμων C. coli κατά τη διάρκεια των τριών πειραματισμών σύμφωνα με όλες τις μεθόδους καταμέτρησης. Ωστόσο, ο βαθμός μείωσης της συγκέντρωσης των βιώσιμων C. coli διέφερε ανάλογα με τη μέθοδο. Κατά μέσο όρο στους τρεις πειραματισμούς, ο πληθυσμός των καμπυλοβακτηριδίων μειώθηκε στο διάστημα των επτά ημερών συντήρησης κατά 0,44 ± 0,03, 0,76 ± 0,06, και 2,89 ± 1,72 λογαρίθμους ανά τεμάχιο κρέατος (επιφάνεια 25 cm2) σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη μοριακή μέθοδο, την καλλιέργεια σε CBA και την καλλιέργεια σε mCCDA, αντίστοιχα. Επιπλέον, ο ημερήσιος μέσος ρυθμός πτώσης του πληθυσμού των βιώσιμων καμπυλοβακτηριδίων κατά τη διάρκεια της συντήρησης του κρέατος προσδιορίστηκε σε 0,06 ± 0,005, 0,11 ± 0,009, και 0,41 ± 0,245 λογαρίθμους βακτηριακών κυττάρων ανά τεμάχιο κρέατος (επιφάνεια 25 cm2) σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη μοριακή μέθοδο, την καλλιέργεια σε CBA και την καλλιέργεια σε mCCDA, αντίστοιχα.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης: Επιβεβαιώθηκε η μόλυνση των σφαγίων αιγών και προβάτων μετά τη σφαγή με ετερογενείς πληθυσμούς θερμόφιλων καμπυλοβακτηριδίων και η ενδεχόμενη συμβολή τους στην επιδημιολογία της καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου. Επιβεβαιώθηκε η μόλυνση των σφαγίων των μικρών μηρυκαστικών σε επίπεδο λιανικής πώλησης με ετερογενείς πληθυσμούς θερμόφιλων καμπυλοβακτηριδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι το κρέας και το ήπαρ των εριφίων και των αμνών που πωλούνται στα κρεοπωλεία μπορούν να αποτελέσουν μέσα για τη μόλυνση του καταναλωτή με Campylobacter. Η καθολική (100,0%) ευαισθησία στη γενταμικίνη καθώς και τα χαμηλά επίπεδα αντοχής στην ερυθρομυκίνη και της ταυτόχρονης αντοχής σε περισσότερες από δύο κατηγορίες αντιμικροβιακών ουσιών που παρουσίασαν τα απομονωθέντα Campylobacter αποτελούν θετικά ευρήματα για τη Δημόσια Υγεία. Τα σχετικά υψηλά επίπεδα αντοχής που εμφάνισαν τα απομονωθέντα Campylobacter στους αντιμικροβιακούς παράγοντες τετρακυκλίνη, στρεπτομυκίνη και κινολόνες, αποτελούν ενδείξεις της διαδεδομένης χρήσης των αντίστοιχων κτηνιατρικών σκευασμάτων σε επίπεδο εκτροφής μικρών μηρυκαστικών στη χώρα μας. Το βελτιστοποιημένο μοριακό πρωτόκολλο v-PCR με PMA, που αναπτύχθηκε κατά την παρούσα έρευνα, προσδιορίζει ποσοτικά τα βιώσιμα (καλλιεργήσιμα και VBNC) κύτταρα του Campylobacter σε σύντομο χρόνο (≈ 8 ώρες) παρουσιάζοντας μεγάλη ειδικότητα ανίχνευσης και μεγάλο εύρος ποσοτικού προσδιορισμού (2,6 x 102 – 5,2 x 108 κύτταρα/ml). Επιβεβαιώθηκε η επιβίωση του C. coli σε κρέας αμνού συντηρημένου σε συνθήκες ψύξης. Η μικρή μεταβολή του πληθυσμού των βιώσιμων βακτηρίων μέχρι και τη χρονική στιγμή της σήψης του κρέατος, που το καθιστά ακατάλληλο για κατανάλωση, επιβεβαίωσε την πιθανότητα διασποράς λοιμογόνων κυττάρων Campylobacter κατά τη συντήρηση του κρέατος στο οικιακό περιβάλλον μέσω της διασταυρούμενης μόλυνσης και τον συνεπαγόμενο κίνδυνο μόλυνσης του καταναλωτή.