Ανοσοπαρεμβατική δράση της κλαριθρομυκίνης στην δευτεροπαθή περιτονίτιτδα

Abstract

Introduction: Sepsis is the leading cause of death in patients suffering from secondary peritonitis, despite surgical treatment and admission in intensive care units on time. The onset of sepsis is characterized by a complex pathogen-host interaction, which leads to increased production of proinflammatory cytokines and induction of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). However, in the course of sepsis, an increased release of anti-inflammatory cytokines takes also place and is associated with the development of the compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS). This syndrome is characterized by enhanced apoptosis of immunocompetent cells, such as lymphocytes and monocytes and immunoparalysis (anergy) of monocytes and should not be underestimated, because it often leads the host to a state of immunodepression. Clinical studies have shown that increased rates of apoptosis of blood lymphocytes and monocytes are associated with decreased survival, while results from experimental studies have demonstrated that inhibition of the apoptotic process as well as of the immunoparalysis of monocytes, with the use of agents that act as immunomodulators, prolongs survival. Furthermore, recent data from experimental models of monomicrobial sepsis showed that clarithromycin, a newer macrolide with proved immunomodulatory effects in chronic inflammatory disorders of the respiratory tract, can act as an immunomodulator in acute inflammatory conditions too, thus prolonging survival of the host. Based on the above data from the literature, the present study was designed in order to examine the efficacy of clarithromycin as an immunomodulatory agent, when administered in an animal model of polymicrobial sepsis due to secondary peritonitis. Materials and methods: Cecal ligation and puncture (CLP) was performed in 60 male New Zealand rabbits, leading to secondary peritonitis. Afterwards, animals were randomly divided in 4 groups with 15 animals in each one and administered intravenously: group A, normal saline only, half an hour and 2 hours after induction of the peritonitis; group B, additionally a single dose of clarithromycin (80 mg/kg), half an hour after induction of the peritonitis; group C, additionally a single dose of piperacillin/tazobactam (400 mg/kg), 2 hours after induction of the peritonitis and group D, additionally clarithromycin and piperacillin/tazobactam in the regimens described above for groups Β and C. Survival of animals was recorded for a total follow-up period of 10 days. Animals remaining alive after 10 days were sacrificed. Autopsy was performed following death and segments from the spleen, right lobe of the liver, right kidney, lower lobe of the right lung and mesenterium were collected for quantitative and qualitative cultures. Furthermore, blood samples were taken from each animal at 2, 4, 24 και 48 hours postoperatively to estimate a) the apoptosis of lymphocytes and monocytes and b) the release of TNF-α from isolated monocytes after stimulation with LPS or Pam3Cys. Apoptosis of 73 lymphocytes and monocytes was measured with flow cytometric analysis after staining the cells with Annexin-V and propidium iodine, while the measurement of released TNF-α from isolated monocytes was based on the cytotoxic effect of TNF-α on an L929 fibrosarcoma cell line. Results: The rate of apoptosis of lymphocytes was lower in groups Β and D compared to that of groups A and C, at 4 and 24 hours postoperatively. More precisely, statistically significant differences were observed between group Β and groups A and C at 4 hours (p=0,015 and 0,028, respectively), between group Β and groups A and C at 24 hours (p=0,046 and 0,02, respectively) and between group D and groups A and C at 24 hours (p=0,008 and 0,003, respectively). Concerning the apoptosis of monocytes, statistical analysis showed that at 24 hours, groups Β and D presented significantly lower rates of apoptosis compared to these of groups A and C (group Β vs. group A p=0,020, group Β vs. group C p=0,006 and group D vs. group C p=0,023). The ex vivo release of TNF-α from isolated monocytes after stimulation with LPS was lower in groups Β and D compared to that in group A, at 2 και 4 hours after CLP; however this difference was not statistically significant. On the contrary, at 24 and 48 hours a reversal of this phenomenon was observed with animals of group Β and D presenting an increase of released TNF-α from their monocytes compared to those of groups A and C. Further statistical analysis revealed significant differences between groups Β and A (p=0,002 at 24 hours and p=0,005 at 48 hours) and groups Β and C (p=0,001 at 24 hours and p=0,003 at 48 hours). The results from quantitative and qualitative tissue cultures showed that the most commonly isolated bacterium was Escherichia Coli, followed by Enterococcus sp. and Proteus sp. Bacterial growth in tissues was significantly lower in groups C and D compared to that in group A. Finally, survival was significantly prolonged in group D compared to group A (p=0,02). Conclusions: Administration of clarithromycin in a model of polymicrobial sepsis due to secondary peritonitis, modulates the host immune response, by decreasing the rate of early apoptosis of blood lymphocytes and monocytes and the rate of immunoparalysis of monocytes, thus resulting in an increased release of TNF-α. Moreover, clarithromycin prolongs survival of the host, when co-administered with broad-spectrum antibiotics.

Εισαγωγή: Η σήψη αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς που πάσχουν από δευτεροπαθή περιτονίτιδα, παρά την έγκαιρη χειρουργική αντιμετώπιση και την νοσηλεία των ασθενών αυτών σε μονάδες εντατικής θεραπείας. Στην εξέλιξη της σήψης σημαντικό ρόλο διαδραματίζει όχι μόνον η αυξημένη παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών που χαρακτηρίζει το SIRS, αλλά και η αντιρροπιστική αντιφλεγμονώδης αντίδραση (CARS), η οποία οφείλεται σε αυξημένη έκκριση αντιφλεγμονωδών κυτοκινών. To CARS χαρακτηρίζεται από επαγωγή της απόπτωσης ανοσοϊκανών κυττάρων όπως τα λεμφοκύτταρα και τα μονοκύτταρα, και από ανοσοπαράλυση των μονοκυττάρων και συχνά οδηγεί σε ανοσοκαταστολή. Κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η αυξημένη απόπτωση των κυκλοφορούντων στο αίμα λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων σχετίζεται με μικρότερη επιβίωση, ενώ από πειραματικές μελέτες προκύπτει ότι η αναστολή της απόπτωσης των κυττάρων αυτών, καθώς και η αναστολή της ανοσοπαράλυσης των μονοκυττάρων με την χρήση παραγόντων που δρουν ανοσοπαρεμβατικά, βελτιώνει την επιβίωση. Από νεότερα δεδομένα σε πειραματικά μοντέλα μονομικροβιακής σήψης προέκυψε ακόμη ότι η κλαριθρομυκίνη, μια νεότερη μακρολίδη με τεκμηριωμένη ανοσοπαρεμβατική δράση σε χρόνιες φλεγμονώδεις παθήσεις του αναπνευστικού, μπορεί να δράσει ανοσοπαρεμβατικά και σε οξείες φλεγμονώδεις καταστάσεις, βελτιώνοντας την επιβίωση του ξενιστή. Τα παραπάνω βιβλιογραφικά δεδομένα αποτέλεσαν το ερέθισμα για την εκπόνηση αυτού του πειραματικού πρωτοκόλλου, που σκοπό είχε την μελέτη της ανοσοπαρεμβατικής δράσης της κλαριθρομυκίνης σε πολύ μικροβιακή σήψη από δευτεροπαθή περιτονίτιδα. Υλικό και μέθοδοι: Ως ζωικά πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν 60 αρσενικοί κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας, στους οποίους προκλήθηκε δευτεροπαθής περιτονίτιδα με την εφαρμογή του πειραματικού προτύπου της απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού (CLP). Ακολούθως τα πειραματόζωα διαιρέθηκαν τυχαία σε 4 ομάδες, με 15 πειραματόζωα σε κάθε μία. Στα πειραματόζωα χορηγήθηκε ενδοφλεβίως: στην ομάδα Α μόνον φυσιολογικός ορός, μισή ώρα και 2 ώρες μετά από την πρόκληση της περιτονίτιδας, στην ομάδα Β επί πλέον μία δόση κλαριθρομυκίνης (80 mg/kg), μισή ώρα μετά από την πρόκληση της περιτονίτιδας, στην ομάδα Γ επί πλέον μία δόση πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης (400 mg/kg), 2 ώρες μετά από την πρόκληση της περιτονίτιδας και στην ομάδα Δ επί πλέον κλαριθρομυκίνη και πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη, στις προαναφερθείσες δόσεις και στα ίδια χρονικά διαστήματα όπως στις ομάδες Β και Γ. Μετά από το τέλος των πειραμάτων τα πειραματόζωα οδηγήθηκαν στον χώρο συντήρησης τους, όπου και παρακολουθήθηκαν μέχρι να καταλήξουν. Όσα επιβίωσαν πέραν της 10ης μετεγχειρητικής ημέρας υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Αμέσως μετά από τον θάνατο τους, τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε νεκροψία, κατά την οποία ελήφθησαν ιστοτεμάχια από τον σπλήνα, τον δεξιό λοβό του ήπατος, τον δεξιό νεφρό, τον κάτω λοβό του δεξιού πνεύμονος και 70 το μεσεντέριο, για την εκτέλεση ποιοτικών και ποσοτικών καλλιεργειών. Επί πλέον, σε όλα τα πειραματόζωα πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες στις 2, 4, 24 και 48 ώρες μετά από την εγκατάσταση της δευτεροπαθούς περιτονίτιδας, για τον προσδιορισμό α) της απόπτωσης των λεμφοκυττάρων και των μονοκυττάρων και β) της παραγωγής TNF-α από τα απομονωμένα μονοκύτταρα μετά από διέγερση τους με LPS ή Pam3Cys. Ο προσδιορισμός του ποσοστού της απόπτωσης των λεμφοκυττάρων και των μονοκυττάρων έγινε με την χρήση Annexin-V και ιωδιούχου προπιδίου και την εκτέλεση κυτταρομετρίας ροής, ενώ ο προσδιορισμός της παραγωγής TNF-α από τα απομονωμένα μονοκύτταρα έγινε με βάση την κυτταροτοξική επίδραση του TNF-a στην κυτταρική σειρά των ινοβλαστών L929. Αποτελέσματα: Το ποσοστό απόπτωσης των λεμφοκυττάρων ήταν χαμηλότερο στις ομάδες Β και Δ σε σχέση με τις ομάδες Α και Γ, στις 4 και 24 ώρες μετά από την πρόκληση της περιτονίτιδας. Συγκεκριμένα, στατιστικά σημαντικές ήταν οι διαφορές μεταξύ της ομάδας Β και των ομάδων Α και Γ στις 4 ώρες (p=0,015 και 0,028, αντίστοιχα), μεταξύ της ομάδας Β και των ομάδων Α και Γ στις 24 ώρες (p=0,046 και 0,02, αντίστοιχα) και μεταξύ της ομάδας Δ και των ομάδων Α και Γ στις 24 ώρες (p=0,008 και 0,003, αντίστοιχα). Αναφορικά με την απόπτωση των μονοκυττάρων, η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι στις 24 ώρες οι ομάδες Β και Δ παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά απόπτωσης σε σχέση με τις ομάδες Α και Γ (ομάδα Β έναντι ομάδας Α p=0,020, ομάδα Β έναντι ομάδας Γ p=0,006 και ομάδα Δ έναντι ομάδας Γ p=0,023). Όσον αφορά στην ex vivo παραγωγή TNF-a από τα απομονωμένα μονοκύτταρα, μετά από διέγερση τους με LPS, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις 2 και 4 ώρες μετά από την πρόκληση περιτονίτιδας η παραγωγή TNF-a ήταν χαμηλότερη στις ομάδες Β και Δ σε σχέση με την ομάδα Α, χωρίς ωστόσο η διαφορά αυτή να είναι στατιστικά σημαντική. Αντίθετα, στις 24 και στις 48 ώρες έλαβε χώρα αναστροφή του παραπάνω φαινομένου, με τα πειραματόζωα των ομάδων Β και Δ να παρουσιάζουν μεγάλη αύξηση του απελευθερούμενου TNF-a από τα μονοκύτταρα τους σε σχέση με αυτά των ομάδων Α και Γ. Περαιτέρω στατιστικός έλεγχος των αποτελεσμάτων έδειξε την ύπαρξη στατιστικά σημαντικών διαφορών στις 24 ώρες μεταξύ της ομάδας Β και της ομάδας Γ (p=0,027), μεταξύ της ομάδας Δ και της ομάδας Α (p=0,001) και μεταξύ της ομάδας Δ και της ομάδας Γ (p<0,001). Στις 48 ώρες οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές μεταξύ της ομάδας Β και της ομάδας Α (p=0,025), μεταξύ της ομάδας Β και της ομάδας Γ (p=0,013), μεταξύ της ομάδας Δ και της ομάδας Α (p=0,001), και μεταξύ της ομάδας Δ και της ομάδας Γ (p<0,001). Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα αναφορικά με την ex vivo παραγωγή TNF-a από τα απομονωμένα μονοκύτταρα μετά από διέγερση τους με Pam3Cys. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε εκ νέου αναστροφή του φαινομένου στις 24 και 48 ώρες, με τα πειραματόζωα των ομάδων Β και Δ να παρουσιάζουν αύξηση του απελευθερωμένου TNF-a από τα μονοκύτταρα τους, σε σχέση με αυτά των ομάδων Α και Γ. Ο στατιστικός έλεγχος των αποτελεσμάτων έδειξε την ύπαρξη στατιστικά σημαντικών διαφορών μεταξύ της ομάδας Β και της ομάδας Α (p=0,002 στις 24 ώρες και 0,005 στις 48 ώρες) και μεταξύ της ομάδας Β και της ομάδας Γ (p=0,001 στις 24 ώρες και 0,003 στις 48 ώρες). Τα αποτελέσματα των καλλιεργειών των ιστοτεμαχίων που λήφθηκαν από τα πειραματόζωα μετά από τον θάνατο τους έδειξαν ότι το συχνότερα απομονούμενο βακτήριο ήταν η Escherichia Coli, 71 ακολουθούμενη από τον Enterococcus sp. και τον Proteus sp. Σε όλα τα ιστοτεμάχια τα οποία καλλιεργήθηκαν, ο αριθμός των βακτηριακών αποικιών που αναπτύχθηκαν ήταν στατιστικά σημαντικά μικρότερος στις ομάδες Γ και Δ, σε σχέση με την ομάδα Α. Τέλος, η μελέτη της επιβίωσης των ζωικών προτύπων έδειξε ότι αυτή ήταν στατιστικά σημαντικά παρατεταμένη στην ομάδα Δ σε σχέση με την ομάδα Α (p=0,02). Συμπεράσματα: Σε πειραματικό μοντέλο πολυμικροβιακής σήψης από δευτεροπαθή περιτονίτιδα η χορήγηση κλαριθρομυκίνης α) τροποποιεί την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή, αναστέλλοντας την πρώιμη απόπτωση των λεμφοκυττάρων και των μονοκυττάρων του αίματος, καθώς και τον βαθμό ανοσοπαράλυσης των μονοκυττάρων, γεγονός, το οποίο σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή TNF-α από αυτά και β) βελτιώνει την επιβίωση του ξενιστή, όταν συνδυάζεται με χορήγηση αντιβιοτικών ευρέος φάσματος.