Μοριακή ανάλυση κλωνικότητας σε διάχυτα β-λεμφώματα από μεγάλα κύτταρα

Abstract

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) represents the most common type of non-Hodgkin’s lymphomas in Western countries (25-30%) and constitutes a disease with great morphological, immunophenotypic and genetic/molecular heterogeneity. The aims of this study included the search of monoclonality in DLBCL cases using molecular techniques, the possible identification of specific rearrangements and their comparison to sequences that are already published in a global database and finally, the identification of the prominent rearrangement within our cases studied.

Our study took place in two stages: During the first stage we determined the proper conditions for the Polymerase Chain Reaction, in order to amplify the three frames (FR1, FR2, FR3) of the B-cell receptor’s heavy chain. The examined factors included the removal of excess paraffin in order to avoid its inhibitory action during PCR, the selection of the proper primers and of the optimum PCR temperatures and component concentrations. The first stage of this study was completed with the sequencing of the rearrangements detected. The second stage of our study consisted of the processing of the aforementioned rearrangements with computational programs such as MEGA 4 and algorithms like BLAST and CLUSTALW. This processing aimed at the comparison of the rearrangements with other already known sequences and at the identification of a possible dominant rearrangement.

Our results showed that monoclonality detected in all the studied cases by using the FR3 specific primers, which therefore we recommend for similar studies. The comparison of sequences, obtained in our study with others already known and the resulting similarities (92-97%), led us to the conclusion that the dominant rearrangement among the cases studied includes the IgHV3-23*01 genes. These genes’ dominance suggests that their “selection” during B-cell maturation is not unbiased and therefore, there should be further research concerning their involvement in the clinical outcome of DLBCL, as well as their possible contribution to therapy.

Οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιλάμβαναν την ανίχνευση μονοκλωνικότητας σε ιστολογικά δείγματα ασθενών με διάγνωση διάχυτο Β-λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (DLBCL) με χρήση μοριακών τεχνικών, την αναγνώριση των εκάστοτε αναδιατάξεων και τη σύγκρισή τους με αλληλουχίες κατατεθειμένες σε παγκόσμια βάση δεδομένων και τέλος την ανίχνευση πιθανής κυρίαρχης αναδιάταξης στα μελετούμενα περιστατικά.

Το πρώτο στάδιο της μελέτης μας περιλάμβανε την εύρεση των κατάλληλων συνθηκών για τη διεξαγωγή πειραμάτων Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, ώστε να επιτευχθεί η ενίσχυση των τριών πλαισίων (FR1, FR2, FR3) της βαριάς αλυσίδας του Β-κυτταρικού υποδοχέα. Παράμετροι οι οποίοι εξετάστηκαν ήταν η απομάκρυνση της παραφίνης ώστε να αποφευχθεί η ανασταλτική δράση της σε αντιδράσεις PCR, η εύρεση των κατάλληλων πριμοδοτικών μορίων και των βέλτιστων θερμοκρασιών και συγκεντρώσεων των αντιδραστηρίων που θα συμμετείχαν στις PCR. Το πρώτο στάδιο της παρούσας μελέτης ολοκληρώθηκε με την αλληλούχιση των αναδιατάξεων που προέκυψαν. Το δεύτερο στάδιο αφορούσε στην επεξεργασία των προαναφερόμενων αναδιατάξεων με υπολογιστικά προγράμματα, όπως το MEGA 4 και με αλγορίθμους, όπως ο BLAST και ο CLUSTALW. Η επεξεργασία αυτή αποσκοπούσε στη σύγκριση των αναδιατάξεων με άλλες γνωστές αλληλουχίες και στην εύρεση πιθανής κυρίαρχης αναδιάταξης.

Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποδεικνύουν την ικανότητα ανίχνευσης μονοκλωνικότητας σε όλες τις μελετηθείσες περιπτώσεις με τη χρήση των πριμοδοτικών μορίων έναντι του FR3, τα οποία συστήνουμε για ανάλογες μελέτες. Η σύγκριση των αλληλουχιών που προέκυψαν από τη μελέτη μας με ήδη γνωστές αλληλουχίες αναδιατάξεων και η ομοιότητά τους σε ποσοστό 92-97% με αυτές, μας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η αναδιάταξη η οποία κυριαρχεί στις μελετηθείσες περιπτώσεις περιλαμβάνει τα γονίδια της οικογένειας IgHV3-23*01. Η κυριαρχία των συγκεκριμένων γονιδίων μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η επιλογή τους κατά την ωρίμανση των Β-λεμφοκυττάρων δεν αποτελεί τυχαίο γεγονός και για το λόγο αυτό θα πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος τους στην εξέλιξη της νόσου και η πιθανή συμβολή τους σε προσπάθειες θεραπευτικής αντιμετώπισης της νόσου