Οι μεταλλάξεις και οι πολυμορφισμοί των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε πάσχοντες από ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος

Abstract

Introduction: Squamous cell carcinoma of the oral cavity is a subset of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and involves the tongue, the upper and lower gingiva and alveolar ridge, the floor of the mouth, the buccal mucosa, the retromolar area, the lip mucosa and the hard palate. The incidence of oral cancer is increasing worldwide. It is estimated that this malignancy is the 11th in frequency and the 13th in cancer-specific mortality worldwide (2). Oral carcinogenesis is considered to involve progressive accumulation of genetic alterations, although up to date, the underlying genetic mechanisms remain unclear and complex (123). Phosphatidylinositol-3 kinases (PI3Ks) constitute a large family of heterodimeric lipid kinases composed of catalytic and adaptor regulatory subunits encompassing three classes1. PIKs are important regulators of cellular growth, transformation, adhesion, apoptosis, survival and motility (51). Once activated by growth factor tyrosine kinases, the PI3K complex is recruited in the inner cell membrane, where PIK3CA phosphorylates its substrate phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2) at the 3-position of the inositol ring, generating the second messenger phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate (PIP3), which in turn recruits the serine-threonine kinase AKT and 3-phosphoinositide-dependant kinase (PDK) to the plasma membrane6. PDK phosphorylates and activates AKT, which then regulates a range of target downstream proteins that control a variety of intracellular proteins. PIK3CA is located on chromosome 3q26.3 and encodes for the catalytic subunit p110a of class ΙΑ PI3K11. Gene amplifications, deletions and more recently, somatic missense mutations in the PIK3CA gene have been reported in many human cancer types including cancers of the colon, breast, brain, liver, stomach and lung (60,61,62). These somatic missense mutations were proposed to increase the kinase activity of PIK3CA. More than 75% of these mutations harbour in the helical (exon 9) and kinase domains (exon 20) of the gene (59). Moreover, the three hotspot mutations, namely E542K, E545K and H1047R, were proven to elevate the enzyme’s lipid kinase activity, to phosphorylate AKT and activate the PI3K-AKT signalling pathway, resulting in transformation in Vitro (124). This evidence shows that PIK3CA acts as an oncogene in many types of cancers. Up to date, studies have shown that PIK3CA is overexpressed in squamous cell carcinoma of the tongue. In addition, hotspot mutations have been reported in HNSCC as well as in advanced stages of oral squamous cell carcinoma in the Japanese population (7.5%). More recently, Murugan et al (66) suggested a differential frequency of PIK3CA mutations in different ethnic group (Indian 10.5%, Vietnamese 0%). Absence of hotspot mutations has also been reported in 33 cases of HNSCC in a German study (69). However, no analysis of PIK3CA genetic alterations and their clinicopathological significance has ever been performed in Greek oral squamous cell carcinoma patients. The present study aimed to determine the contribution of PIK3CA hotspot mutations in the pathogenesis of oral squamous cell carcinoma in a Greek population. The primary working hypothesis was that PIK3CA hotspot mutations appear in later stages of OSCC after the accumulation of mutations in other genetic loci, as suggested by Kozaki et al (44). To test this hypothesis, we performed a large scale screening of PIK3CA hotspot mutations in exons 9 and 20 by direct genomic DNA sequencing in paraffin5 embedded primary tumors of 86 consecutive cases of OSCC that were operated for their cancer. Materials and Methods: Specimens from 86 consecutive patients, who underwent a major operation for their cancer, were retrieved from the files of the Department of Oral and Maxillofacial Surgery and Pathology at the Evagelismos Hospital, University of Athens, Athens from 2003 to 2007. In addition, blood samples for 26 age and sex matched normal control volunteers, were also collected. Demographic preoperative and postoperative data were available for all patients. The patients were staged according to the International Union Against Cancer (3). This work has been approved both by the ethical Committees of Evagelismos Hospital and the University of Athens. The genomic DNA was extracted with the QIAmp extraction DNA kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). This was followed by PCR to amplify the genetic material. Two sets of primers were used for the PCR technique and a DNA sequencing protocol followed the procedure. Results Out of the 86 patients, 17 (19.8%) were stage I, 12 (14%) were stage II, 14 (16.3%) stage III and 43 (50%) were stage IV, according to the pTNM staging system. Thirty one patients (36%) had cancer of the tongue, 8 (9.3%) of the floor of the mouth, 25 (29.1%) of the lower gingival and alveolar ridge, 4 (4.7%) of the upper gingiva, 9 (10.5%) of the buccal mucosa, 6 (7%) of the retromolar area and 3 (3.5%) patients had cancer of the lip mucosa. The histological grading was as follows: well-differentiated in 17 (21%) patients, moderately-differentiated in 56 (69.1%) patients and poorly-differentiated in 8 (9.9%) patients. Contrary to expectations, no hotspot mutations in exons 9 and 20 were identified in the specimens tested. We detected two polymorphisms previously described in the intronic region flanking exon 9, IVS8 -55 C>T (rs45455192) and IVS9 +105 T>G (rs 17849071). Polymorphism IYS8 was found in 18.6% (16 patients) and polymorphism IVS9 in 19.8% (17 patients). All patients with polymorphisms were heterozygous. In the control group, the frequencies of IVS8 and IVS9 were 7.7% and 11.5%, respectively. An increased frequency of IVS8 was found in squamous cell carcinoma of the buccal mucosa (44%, 4 out of 9). IVS9 was mainly found in the lower gingival, alveolar mucosa (44%, 11 out of 25) and buccal mucosa (33.3%, 3 out of 9). A significant difference was found between the frequencies of IVS8 and IVS9 in different sites (Pearson Chi- square 28.2, p-value 0.005), although a larger sample size is needed in order to establish such a conclusion. Discussion In the present study no mutations of the PIK3CA gene were detected in 86 patients with OSCC, although the majority of the patients were stage IV, which is in contrast with other studies (66). This finding could be attributed to ethnic differences (90,91). We detected two polymorphisms previously described in the intronic region flanking exon 9, IVS8 -55 C>T (rs45455192) and IVS9 +105 T>G (rs17849071) (92), whereas polymorphism ivs9 has been previously reported in squamous cell carcinoma at 10,5%. Polymorphism ivs8 is a novel finding in oral squamous cell carcinoma. These polymorphisms seemed to be mutually exclusive. Conclusions: It seems unlikely that hotspot mutations of the PIK3CA gene are involved in OSCC in a Greek population. Other mechanisms of PIK3CA activation or mutations of other oncogenes may be involved in the pathogenesis of the disease.

Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας αποτελεί μια υποκατηγορία του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της κεφαλής και του τραχήλου και περιλαμβάνει τους βλεννογόνους της στοματικής μοίρας της γλώσσας, της φατνιακής απόφυσης της άνω και κάτω γνάθου, του εδάφους του στόματος, της παρειάς, του οπισθογόμφιου τριγώνου, του χείλους και της σκληράς υπερώας. Η επίπτωση του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας αυξάνει σε παγκόσμια κλίμακα. Υπολογίζεται ότι βρίσκεται μεταξύ 11ης και 13ης θέσης σε θανάτους από καρκίνο παγκοσμίως (2). Η καρκινογένεση των όγκων αυτών θεωρείται ότι προκαλείται από τη συσσώρευση γενετικών αλλαγών, παρόλο που, μέχρι σήμερα, οι ακριβείς γενετικοί μηχανισμοί παραμένουν σύνθετοι και αδιευκρίνιστοι (123). Οι κινάσες των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης (PI3Ks) περιλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια ετεροδιμερών λιπιδιακών κινασών που ανήκουν σε τρεις τάξεις και αποτελούνται από μια καταλυτική υπομονάδα και μια υπομονάδα υποδοχέα. Οι κινάσες αυτές είναι σημαντικοί ρυθμιστές της κυτταρικής αύξησης, του μετασχηματισμού, της προσκόλλησης, της απόπτωσης, της επιβίωσης και της κινητικότητας (51). Μόλις ενεργοποιηθούν από τις τυροσινικές κινάσες των αυξητικών παραγόντων, οι κινάσες των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης μεταφέρονται στο εσωτερικό της κυτταρικής μεμβράνης, όπου φωσφορυλιώνουν το υπόστρωμά τους, δηλαδή την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη (ΡΙΡ2) στην 3-θέση του δακτυλίου της ινοσιτόλης, σχηματίζοντας έτσι έναν δεύτερο αγγελιοφόρο την 3,4,5, τριφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη (ΡΙΡ3), που με τη σειρά της, μεταφέρει την κινάση σερίνης-θρεονίνης AKT και εξαρτώμενη από την ΡΙΡ3 κινάση (PDK), στο εσωτερικό της μεμβράνης (6). Η PDK φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την AKT, που ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών με πολλές ενδοκυττάριες λειτουργίες. Το γονίδιο PIK3CA βρίσκεται στο γενετικό τόπο 3q26.3 και κωδικοποιεί για την καταλυτική υπομονάδα p110α της τάξης ΙΑ ΡΙ3Κ (11). Στο γονίδιο αυτό έχουν αναφερθεί γενετικές αλλαγές όπως αύξηση του αριθμού των αντιγράφων, διαγραφές και πιο πρόσφατα μεταλλάξεις με λάθος νόημα, σε πολλούς τύπους καρκίνου, όπως του παχέως εντέρου, του μαστού, του εγκεφάλου, του στομάχου και του πνεύμονα (60,61,62). Οι μεταλλάξεις με λάθος νόημα έχουν ενοχοποιηθεί για αύξηση της δραστηριότητας του PIK3CA. Περισσότερες από 75% αυτών των μεταλλάξεων βρίσκονται στην περιοχή της έλικας (εξόνιο 9) και στην περιοχή της κινάσης (εξόνιο 20) του γονιδίου (59). Επιπλέον, οι τρεις συχνότερες από αυτές τις μεταλλάξεις, δηλαδή οι Ε542Κ, Ε545Κ και H1047R ονομάζονται και θερμές μεταλλάξεις, και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ενεργότητα της κινάσης φωσφορυλιώνοντας την AKT, οδηγώντας το κύτταρο σε εξαλλαγή in Vitro (124). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το PIK3CA λειτουργεί σαν ογκογονίδιο σε πολλούς τύπους καρκίνου. Μέχρι σήμερα, οι έρευνες δείχνουν ότι το PIK3CA υπερεκφράζεται στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της γλώσσας. Επιπλέον, θερμές μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου και συγκεκριμένα σε προχωρημένα στάδια της νόσου σε Ιάπωνες ασθενείς (7,5%). Πιο πρόσφατα οι Murugan και συν. (66) πρότειναν ότι το ποσοστό των μεταλλάξεων διαφέρει ανάλογα με την εθνικότητα (Ινδοί 10,5% και Βιετναμέζοι 0%). Απουσία επίσης θερμών μεταλλάξεων έχει επίσης αναφερθεί σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της κεφαλής και του τραχήλου στους Γερμανούς (69). Μέχρι σήμερα η ανάλυση των μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA και της κλινικοπαθολογικής σημασίας του δεν έχει πραγματοποιηθεί στον Ελληνικό πληθυσμό. Η ερευνητική αυτή εργασία είχε σαν στόχο τη διερεύνηση των θερμών μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας στον Ελληνικό πληθυσμό. Η υπόθεση που διερευνήθηκε ήταν ότι οι θερμές μεταλλάξεις του γονιδίου PIK3CA εμφανίζονται σε προχωρημένα στάδια του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας, όπως αρχικά προτάθηκε από τους Kozaki και συν. (44). Για τη διερεύνηση αυτής της υπόθεσης, έγινε έλεγχος των βάσεων του DNA των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε 86 πάσχοντες από ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας που χειρουργήθηκαν για τον καρκίνο τους. Υλικό και μέθοδος: Για την ερευνητική αυτή εργασία χρησιμοποιήθηκε υλικό από τους πρωτοπαθείς όγκους 86 ασθενών με ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας που χειρουργήθηκαν για τη νόσο τους. Οι ασθενείς χειρουργήθηκαν στην Πανεπιστημιακή Κλινική της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής του νοσοκομείου Ευαγγελισμός από τον Ιανουάριο του 2003 μέχρι το Δεκέμβριο του 2007. Επιπλέον, σαν ομάδα ελέγχου ελήφθη περιφερικό αίμα από 26 υγιείς εθελοντές αντιστοίχου φύλου και ηλικίας με τους πάσχοντες. To DNA των κυττάρων του αίματος και το DNA των κυττάρων του βλεννογόνου του στόματος στους υγιείς μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ταυτόσημο. Έτσι, η λήψη ιστοτεμαχίου βλεννογόνου του στόματος στους υγιείς δεν κρίθηκε αναγκαία. Στους υγιείς ζητήθηκε και εδόθη συγκατάθεση. Η επιλογή του παθολογοανατομικού υλικού έγινε σε συνεργασία με τους ιατρούς της Παθολογικής Ανατομικής κλινικής με ιδιαίτερη έμφαση στην επιλογή κυρίως καρκινικών κυττάρων και όχι υγιούς ιστού. Στη συνέχεια έγινε εξαγωγή του γενωμικού DNA με τη βοήθεια του QIAmp extraction DNA kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τον πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος PCR. Δύο σετ εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση σημειακών αλλαγών των εξονίων και στη συνέχεια ακολούθησε άμεση αλληλούχιση του DNA. Τα δημογραφικά στοιχεία, τόσο τα προεγχειρητικά, όσο και τα μετεγχειρητικά, ήταν διαθέσιμα για όλους τους ασθενείς. Οι ασθενείς σταδιοποιήθηκαν σύμφωνα με το International Union Against Cancer (3). Η εργασία αυτή εγκρίθηκε από τις επιτροπές ηθικής και δεοντολογίας του Ευαγγελισμού και της Οδοντιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Αποτελέσματα Από τους 86 ασθενείς οι 17 (19,8%) ήταν σταδίου I, οι 12 (14%) σταδίου II, οι 14 (16,3%) σταδίου III και οι 43 (50%) σταδίου IV σύμφωνα με τη σταδιοποίηση pTNM. Τριανταένα ασθενείς (36%) είχαν καρκίνο της γλώσσας, 8 (9,3%) καρκίνο του εδάφους του στόματος, 25 (29,1%) καρκίνο της φατνιακής απόφυσης της κάτω γνάθου, 4 (4,7%) καρκίνο της φατνιακής απόφυσης της άνω γνάθου, 9 (10,5%) είχαν ως εντόπιση του καρκίνου τους την παρειά, 6 (7%) το οπισθογόμφιο τρίγωνο και 3 (3,5%) το βλεννογόνο του χείλους. Ο βαθμός της ιστολογικής διαφοροποίησης χαρακτηρίστηκε υψηλός σε 17 ασθενείς (21%), μέτριος σε 56 (69,1%) και χαμηλός σε 8 (9,9%) ασθενείς. Σε αντίθεση με τις προσδοκίες των ασθενών δεν ανευρέθησαν θερμές μεταλλάξεις στα εξόνια 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε κανένα από τα δείγματα. Στα δείγματα ανευρέθησαν δύο πολυμορφισμοί στις περιοχές του ιντρονίου 9, δηλαδή οι IVS8 -55 C>T (rs45455192) και IVS9 +105 T>G (rs17849071). Ο πολυμορφισμός IVS8 βρέθηκε σε 18,6% των ασθενών (16 άτομα), ενώ ο πολυμορφισμός IVS9 σε ποσοστό 19,8% (17 ασθενείς). Σε όλους τους ασθενείς οι πολυμορφισμοί βρίσκονταν σε ετερόζυγη κατάσταση. Στην ομάδα ελέγχου οι πολυμορφισμοί IVS8 και IVS9 βρέθηκαν σε ποσοστά 7,5 και 11,5% αντίστοιχα. Η διαφορά αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική (p>0,05). Ο πολυμορφισμός IVS8 βρέθηκε στα δείγματά μας σε αυξημένη συχνότητα στο βλεννογόνο της παρειάς (44%, 4 στα 9 δείγματα). Επιπλέον ο πολυμορφισμός IVS9 βρέθηκε κυρίως στο βλεννογόνο της φατνιακής απόφυσης της κάτω γνάθου (44%, 11 στα 25 δείγματα) και στο βλεννογόνο της παρειάς (33,3%, 3 στα 9 δείγματα). Οι διαφορές αυτές στη συχνότητα της εντόπισης των πολυμορφισμών ήταν στατιστικά σημαντικές (Κριτήριο χ²= 28.2, p-τιμή 0.005), αν και το μέγεθος του δείγματος ήταν μικρό. Συζήτηση: Αναλύοντας 86 δείγματα από ιστολογικά παρασκευάσματα πρωτοπαθών ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων του βλεννογόνου του στόματος δε βρέθηκαν μεταλλάξεις στα εξόνια 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA. Αντίθετα, άλλοι ερευνητές έχουν ανιχνεύσει μεταλλάξεις σε ποσοστό ως και 10,5% (66). Αυτό πιθανό να εξηγείται από το ότι οι μεταλλάξεις μερικών γονιδίων σε ανθρώπινους καρκίνους πιθανόν να σχετίζονται με την εθνικότητα (90,91). Κάτι αντίστοιχο μπορεί να ισχύει και για το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος. Στα δείγματα ανευρέθησαν δύο πολυμορφισμοί στις περιοχές του ιντρονίου 9, δηλαδή οι IVS8 -55 C>T (rs45455192) και IVS9 +105 T>G (rs17849071) (92). Ο πολυμορφισμός IVS9 έχει περιγραφεί πάλι σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου σε 4 από τα 38 δείγματα (10,5%) (67). Αντίθετα ο πολυμορφισμός IVS8 είναι ένα νέο εύρημα στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος. Συμπεράσματα: Οι μεταλλάξεις των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA δεν θεωρείται πιθανό ότι παίζουν σημαντικό τουλάχιστον ρόλο στην παθογένεση του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας στον Ελληνικό πληθυσμό. Άλλοι μηχανισμοί ενεργοποίησης του γονιδίου PIK3CA ή μεταλλάξεις σε άλλα ογκογονίδια είναι πιθανόν να εμπλέκονται με την παθογένεση της νόσου.