Σύνθεση λειτουργικών δενδριτικών πολυμερών και μελέτη εγκλεισμού και ελεγχόμενης αποδέσμευσης βιοδραστικών μορίων

Abstract

In the present study, derivatives of diaminobutane poly(propylene–imine) dendrimer DAB32, of hyperbranched polyglycerol PG5 and of hyperbranched polyester BH40 were prepared. The functionalisation of the dendritic macromolecules was achieved by employing methods that are usually followed for the preparation of analogous compounds. The ability of these derivatives to encapsulate and release bioactive molecules in a controlled manner was studied. Specifically, derivatives of diaminobutane poly(propylene–imine) dendrimer bearing different number of polyethylene glycol (PEG) moieties attached at their surface groups (three, six and twelve PEG chains) were prepared. The protective role of PEG in biological milieu was combined with the targeting properties of folic acid in another derivative of DAB32. Also, two derivatives of hyperbranched polyglycerol bearing two and ten PEG chains, respectively, as well as a multifunctional derivative bearing PEG chains, as protective ligands, and folic acid, as targeting group, were prepared. Functionalisation of hyperbranched polyester was achieved by introducing PEG chains at the surface of the dendritic polymer. All derivatives were characterized with NMR, fluorescence and UV spectroscopy. The ability of the functional dendritic macromolecules prepared to act as drug delivery systems, was investigated using well–known anti–cancer drugs. So, derivatives of diaminobutane poly(propylene–imine) dendrimer were tested as potential carriers of Etoposide. In the case of hyperbranched polyglycerol derivatives Tamoxifen was employed, while functional hyperbranced polyester was tested as potential carrier of both Tamoxifen and Taxol. Cytotoxicity of all dendrimers was evaluated using HEK–293 and A549 cell lines. Furthermore, the role of folate during the entrance of multifunctional derivatives to cancer cells was examined. Specifically, a comparative study between derivatives bearing PEG chains and folic acid and derivatives bearing the same number of PEG chains but no folic acid, was conducted. The cell line used for this study was MDA.MB.468, which is a cell line expressing folate receptors. Cells incubated with FITC–labelled derivatives of the functional dendritic polymers used for this study, were observed under a confocal microscope, in order for the difference in the ability of each derivative to enter cells to be estimated.

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε τροποποίηση του διαμινοβουτανιο πολυ(προπυλενο–ιμινο) δενδριμερούς DAB32, της υπερδιακλαδισμένης πολυγλυκερόλης PG5 και του υπερδιακλαδισμένου πολυεστέρα BH40. Η τροποποίηση των δενδριτικών μακρομορίων επιτεύχθηκε με τη χρησιμοποίηση πειραματικών συνθηκών αντίστοιχων με εκείνες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για τη σύνθεση ανάλογων ενώσεων. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα των παραγώγων που παρελήφθησαν να εγκλείουν και να αποδεσμεύουν ελεγχόμενα βιοδραστικές ουσίες. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε μια σειρά παραγώγων των δενδριτικών μακρομορίων με το γραμμικό πολυμερές της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Έτσι, αρχικά ετοιμάστηκαν τρία παράγωγα του διαμινοβουτανιο πολυ(προπυλενο–ιμινο) δενδριμερούς DAB32 που το κάθε ένα έφερε διαφορετικό αριθμό αλυσίδων PEG στην επιφάνειά του (τρεις, έξι και δώδεκα αλυσίδες). Ακολούθως, παρασκευάστηκε ένα πολυλειτουργικό παράγωγο του δενδριμερούς αυτού το οποίο, εκτός από τις αλυσίδες PEG, έφερε και μια μονάδα φολικού οξέος. Το παράγωγο αυτό συνδύασε τόσο ιδιότητες στόχευσης, λόγω του φολικού οξέος, όσο και προστασίας, λόγω της πολυαιθερικής αλυσίδας. Η πολυαιθερική αλυσίδα μπορεί να προστατεύσει περαιτέρω το φορέα καθώς επίσης και την εγκλεισμένη δραστική ουσία, όταν αυτά εκτίθενται σε βιολογικό περιβάλλον. Επιπλέον, παρασκευάστηκαν δύο παράγωγα της υπερδιακλαδισμένης πολυγλυκερόλης PG5 με διαφορετικό αριθμό αλυσίδων πολυαιθυλενογλυκόλης στην επιφάνεια του μακρομορίου (δύο και δέκα αλυσίδες). Όπως συνέβη και με το αμινοτελικό δενδριμερές, συνετέθη επιπλέον ένα παράγωγο της πολυγλυκερόλης στο οποίο κάθε μια από τις πολυαιθερικές αλυσίδες που υπήρχαν στην επιφάνειά του, έφεραν στο άλλο τους άκρο μια μονάδα φολικού οξέος. Αντίστοιχα, πραγματοποιήθηκε η τροποποίηση του υπερδιακλαδισμένου πολυεστέρα BH40 με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης. Τα παράγωγα που παρασκευάστηκαν χαρακτηρίστηκαν με χρήση φασματοσκοπίας NMR, φθορισμού και υπεριώδους. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η δυνατότητα κάθε ενός από τα παράγωγα που παρελήφθησαν να εγκλείουν φάρμακα και να τα αποδεσμεύουν με ελεγχόμενο τρόπο. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν τα παράγωγα του διαμινοβουτανιο πολυ(προπυλενο–ιμινο) δενδριμερούς ως φορείς εγκλεισμού του φαρμάκου Etoposide. Η δυνατότητα των παραγώγων της υπερδιακλαδισμένης πολυγλυκερόλης να δράσουν ως φορείς φαρμάκων μελετήθηκε με τη χρήση του φαρμάκου Tamoxifen. Το ίδιο φάρμακο (Tamoxifen) χρησιμοποιήθηκε στην περίπτωση του παραγώγου του υπερδιακλαδισμένου πολυεστέρα. Στην περίπτωση αυτή πραγματοποιήθηκε περαιτέρω μελέτη με χρήση ενός δεύτερου γνωστού αντικαρκινικού φαρμάκου, του Taxol. Πραγματοποιήθηκε εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας των παραγώγων που παρασκευάστηκαν προς τις κυτταρικές σειρές ΗΕΚ–293 και Α549. Επιπλέον, διερευνήθηκε η δυνατότητα τους να εισαχθούν στα κύτταρα καθώς επίσης και ο ρόλος του φολικού οξέος στην πορεία της εισόδου των πολυλειτουργικών δενδριτικών συστημάτων σε καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη μεταξύ των παραγώγων εκείνων που έφεραν πολυαιθυλενογλυκόλη και φολικό οξύ στην περιφέρειά τους και εκείνων που έφεραν τον ίδιο με αυτά αριθμό αλυσίδων πολυαιθυλενογλυκόλης αλλά όχι φολικό οξύ. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε η MDA.MB.468 καρκινική κυτταρική σειρά, στην οποία παρατηρείται έκφραση των υποδοχέων του φολικού οξέος. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα επισημασμένα με 5– ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) παράγωγα των τροποποιημένων μακρομορίων που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη και παρατηρήθηκαν σε Συνεστιακό Μικροσκόπιο, ώστε να προσδιοριστεί η διαφορά στο βαθμό εισόδου στο κύτταρο κάθε ενός από τα δενδριτικά παράγωγα.