Νανοαποτύπωση βιομορίων με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον σε πολυμερικούς φορείς για εξειδικευμένη αναγνώριση και διαχωρισμό

Abstract

Molecular imprinting of polymers is a technique to create selective recognition sites within a synthetic polymer network via the template polymerization process. The main goal of the present thesis was the investigation of the parameters influencing the molecular imprinting process as to create artificial polymeric receptors for the selected molecules. For the synthesis of molecularly imprinted polymers (MIP) the following templates were used: the amino acids L-methionine and L-lysine, the biogenic amine histamine, the C-terminal pentapeptide of cholecystokinin (CCK-5) and cytochrome c. For the synthesis of molecularly imprinted polymers for the amino acids, precipitation polymerization was employed. Several parameters that influence the imprinting phenomenon were investigated (functional monomer to cross-linker ratio, type of initiation and concentration of the initiator). In the case of L-methionine, it was found that both the concentration of the initiator and the type of initiation influence the imprinting process. Specifically, UV-polymers had similar morphological characteristics and higher affinity for the template molecule compared to their thermal counterparts. Regarding L-lysine, affinity of the imprinted polymers for the template was observed only in the case of UV initiation while thermal polymers exhibited poor affinity for the template.The next aim of the present study was the synthesis of molecularly imprinted polymers for histamine. Initially, bulk polymerization was employed. MIPs affinity and recognition mechanisms were investigated both in aqueous and organic media, as well as affinity against structurally and functionally related to histamine compounds. In aqueous environment, imprinted polymers selectively recognized histamine over L-histidine, putrescine and a putrescine’s analogue and histamine antagonist-ranitidine. In organic environment, imprinted polymers selectively recognized histamine against histamine’s antagonists, fluoxetine, ranitidine and dimentidene. When imprinted polymers were employed as stationary phases in solid phase extraction, the separation of histamine from putrescine (normal phase) and taurine (reversed phase) was achieved. Molecular imprinting of histamine was proceeded with precipitation polymerization. The influence of porogen’s polarity on polymers affinity was investigated. It was shown that the increment of porogen’s polarity resulted in a reduction of template-functional monomer interactions. As a consequence, the number of affinity binding sites was reduced. The final goal of the present project was the molecular imprinting of the C-terminal pentapeptide of cholecystokinin (CCK-5) and cytochrome c. Molecularly imprinted polymers for CCK-5 were prepared using the precipitation method. The polymers were synthesized according to the epitope approach and demonstrated positive results. Regarding cytochrome c, polyacrylamide gels were chosen due to the inert polymerization conditions. It was found that the combination of two functional monomers had a positive impact on polymers affinity. In particular, the combination of acrylamide and methacrylic acid enhanced the imprinted gels affinity for cytochrome c.The molecular imprinting of polymers is a new research area with numerous applications. In the following years, molecularly imprinted polymers have to overcome many limitations until they are considered as artificial antibodies.

Η μοριακή αποτύπωση πολυμερών είναι μια τεχνική με την οποία δημιουργούνται επιλεκτικές θέσεις αναγνώρισης στο πολυμερικό πλέγμα ικανές να αναγνωρίζουν εξειδικευμένα το μόριο-εκμαγείο που χρησιμοποιήθηκε κατά την αντίδραση πολυμερισμού. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν το φαινόμενο της μοριακής αποτύπωσης με απώτερο σκοπό τη σύνθεση πολυμερών που έχουν μοριακή μνήμη για τα επιλεγμένα μόρια αποτύπωσης. Τα βιομόρια που χρησιμοποιήθηκαν στη διατριβή είναι τα αμινοξέα L- μεθειονίνη και L- λυσίνη, η βιογενής αμίνη ισταμίνη, το πενταπεπτίδιο της χολεστοκινίνης (CCK-5) και το κυτόχρωμα c.Πρωταρχικό στόχο της διατριβής, αποτέλεσε η μοριακή αποτύπωση των αμινοξέων L- μεθειονίνη και L- λυσίνη. Η σύνθεση των πολυμερών έγινε με τη τεχνική της καθίζησης και μελετήθηκαν οι παράμετροι που επηρεάζουν το φαινόμενο της μοριακής αποτύπωσης (αναλογία λειτουργικού μονομερούς-μέσου δικτύωσης, εκκίνηση του πολυμερισμού, συγκέντρωση του εκκινητή). Στη μοριακή αποτύπωση της L-Met, βρέθηκε ότι η συγκέντρωση του εκκινητή πολυμερισμού και ο τρόπος εκκίνησης του πολυμερισμού επηρέασε τη μορφολογία των πολυμερών και το φαινόμενο της μοριακής αποτύπωσης. Πιο ειδικά, βρέθηκε ότι ο φωτοχημικός πολυμερισμός δίδει πολυμερή που έχουν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά και μεγαλύτερη αγχιστεία για το μόριο αποτύπωσης σε σχέση με τα θερμικά πολυμερή. Στην περίπτωση της L-Lys, βρέθηκε ότι η σύνθεση μοριακά αποτυπωμένων πολυμερών με τη μέθοδο της καθίζησης είναι εφικτή μόνο με φωτοχημική εκκίνηση του πολυμερισμού, καθώς ο θερμικός πολυμερισμός δεν είχε θετικά αποτελέσματα.Επόμενο εγχείρημα της διατριβής αποτέλεσε η σύνθεση μοριακά αποτυπωμένων πολυμερών για την ισταμίνη. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του πολυμερισμού μάζας. Η αγχιστεία και ο μηχανισμός αναγνώρισης των πολυμερών για την ισταμίνη ελέγχθηκε σε οργανικό και υδατικό περιβάλλον και έναντι ενώσεων που έχουν παρόμοιο δομικό και λειτουργικό ρόλο με την ισταμίνη. Βρέθηκε ότι σε υδατικό περιβάλλον τα πολυμερή αναγνωρίζουν επιλεκτικά την ισταμίνη έναντι της L-ιστιδίνης, της πουτρεσκίνης και ενός αναλόγου της πουτρεσκίνης και του ανταγωνιστή της ισταμίνης-ρανιτιδίνη. Σε οργανικό περιβάλλον, τα αποτυπωμένα πολυμερή αναγνώρισαν εκλεκτικά την ισταμίνη έναντι των ανταγωνιστών της ισταμίνης, φλουοξετίνη, ρανιτιδίνη, και διμεθυδίνη. Τέλος, η εφαρμογή των αποτυπωμένων πολυμερών ως υλικά πλήρωσης στην εκχύλιση στερεάς φάσης έδειξε ότι διαχωρίζουν την ισταμίνη από την πουτρεσκίνη (λειτουργία κανονικής φάσης) και τη ταυρίνη (λειτουργία αντίστροφης φάσης). Στη συνέχεια, προχωρήσαμε στη σύνθεση μοριακά αποτυπωμένων σφαιριδίων για την ισταμίνη με τη μέθοδο της καθίζησης, όπου μελετήθηκε η επίδραση της πολικότητας του διαλύτη πολυμερισμού στο φαινόμενο της μοριακής αποτύπωσης. Βρέθηκε ότι η αύξηση της πολικότητας του διαλύτη πολυμερισμού είχε ως αποτέλεσμα να ελλατωθούν οι αλληλεπιδράσεις ισταμίνης-λειτουργικού μονομερούς, μειώνοντας τις εξειδικευμένες θέσεις αναγνώρισης στα αποτυπωμένα πολυμερή. Ένα επίσης σημαντικό εγχείρημα, αποτέλεσε η μοριακή αποτύπωση του πεπτιδίου της χολεστοκινίνης (CCK-5) και του κυτοχρώματος c. Βασιζόμενοι στην επιτόπια μέθοδο, έγινε αποτύπωση του πεπτιδίου με τη μέθοδο της καθίζησης σε ακετονιτρίλιο δίνοντας αρκετά ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Για τη μοριακή αποτύπωση του κυτοχρώματος c χρησιμοποιήθηκαν οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λόγω των μη μετουσιωτικών συνθηκών πολυμερισμού. Βρέθηκε ότι η αγχιστεία των πηκτών για την πρωτεΐνη αυξάνεται όταν χρησιμοποιείται μίγμα δύο μονομερών. Συγκεκριμένα, όταν χρησιμοποιούνται συνδυαστικά το ακρυλαμίδιο και το μεθακρυλικό οξύ, αυξάνεται σημαντικά η αγχιστεία των πηκτών για το κυτόχρωμα c.Η μοριακή αποτύπωση πολυμερών αποτελεί ένα νέο σχετικά πεδίο έρευνας με ποικίλες εφαρμογές. Τα επόμενα χρόνια καλείται να αντιμετωπίσει πολλές προκλήσεις μέχρι τα αποτυπωμένα πολυμερή χαρακτηριστούν ως τεχνητά αντισώματα.