Μελέτη του φαινομένου της αυτόλυσης και της μορφολογίας του μύκητα Blakeslea trispora κατά την παραγωγή του β-καροτένιου από τυρόγαλα σε ζύμωση βυθού

Abstract

In the present study the production of carotenes from deproteinized hydrolyzed cheese whey by mated cultures of Blakeslea trispora in submerged fermentation was investigated. Moreover, the fungal morphology and the autolysis of Blakeslea trispora were also studied. The purpose of this study was the utilization of an extreme environmental pollutant of milk industry (such as cheese whey) for carotenes production. For the achievement of this objective, the effect of nutrients (such as natural oils, non-ionic surfactants, nitrogen sources, vitamins, minerals, β-ionone, lecithin) was examined. A central composite design was employed to determine the maximum carotenes concentration at optimum values for the process variables (Tween 80, Span 80, β-ionone). The effect of the ratio of (+) and (-) mating type of B. trispora on carotenes production was also studied. The highest carotenes concentration in shake flask culture was 175 mg/g dry biomass. Furthermore, the morphology of the fungus was studied during carotenes production in shake flask culture. B. trispora growing in submerged fermentation is able to develop complex morphologies which have been classified into three major groups: freely dispersed hyphae, clumps and pellets. It appeared that there is a parallel relationship between the number of dispersed mycelia and pigments formation and, also, there is a significant influence of the supplementation of non-ionic surfactants and the ratio of inoculum on the reduction of pellets projected area. Additionally, the production of carotenes from deproteinized hydrolyzed whey by B. trispora in stirred tank fermentor and airlift reactor was examined. In stirred tank fermentor the concentration of carotenes was very low (35.0 mg/g dry biomass). In contrast, in airlift reactor the effect of aeration rate affected significantly on carotenes production. In this case the maximum concentration of carotenes was 222.0 mg/g dry biomass. Also, the identification of carotenes in B. trispora was analyzed with HPLC. The carotenes content in B. trispora whey were β-carotene, γ-carotene, and lycopene. The major accumulated compound was β-carotene. The process of cellular autolysis of B. trispora was studied in deproteinized - hydrolyzed whey supplemented with Tween 80 (30.0 g/l), Span 80 (30.0 g/l), and β-ionone (2.0 g/l) in shake flask culture and in airlift reactor. A range of methods such as changes in dry biomass, carotenes concentration, residual sugars, pH, concentration of intracellular protein and specific activity of hydrolytic enzymes (proteases, chitinase) are examined as indicators to assess the extent of autolysis. Also, a semi-automated image analysis system was used to assess the morphological changes during autolysis. The main phases of autolysis were more distinctive in the case of airlift reactor. In both fermentation systems, autolysis appeared after the 2nd day of incubation. The phenomenon of autolysis was associated with an increase of the specific activity of hydrolytic enzymes, decrease of intracellular protein concentration and changes in the morphology of B. trispor

Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η δυνατότητα βελτίωσης της απόδοσης και της παραγωγικότητας των καροτενίων από αποπρωτεϊνομένο - υδρολυμένο τυρόγαλα με το μύκητα Blakeslea trispora σε ζύμωση βυθού. Παράλληλα εξετάστηκε το φαινόμενο της αυτόλυσης του μύκητα κατά τη διάρκεια της παραγωγής των καροτενίων από τυρόγαλα. Η συγκεκριμένη έρευνα είχε σαν στόχο την αξιοποίηση ενός εξαιρετικά ρυπογόνου αποβλήτου της βιομηχανίας γάλακτος, του τυρογάλακτος, σε συνδυασμό με την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, όπως είναι τα καροτένια. Για την επίτευξη του στόχου αυτού μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων ουσιών (φυτικά έλαια, γαλακτωματοποιητές, πηγές αζώτου, βιταμίνες, ιχνοστοιχεία, β-ιονόνη, λεκιθίνη) στις κινητικές παραμέτρους της ζύμωσης. Εφαρμόστηκε μαθηματικό μοντέλο πρόβλεψης και μελετήθηκε η επίδραση της αναλογίας του εμβολίου στην παραγωγή των καροτενίων. Η μεγαλύτερη παραγωγή των καροτενίων στο σύστημα των ανακινούμενων κωνικών φιαλών ήταν 175,0 mg/g ξηρής βιομάζας. Παράλληλα, διερευνήθηκε η επίδραση των μορφολογικών παραμέτρων του μύκητα Β. trispora στην παραγωγή των καροτενίων. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης ο μύκητας σχημάτιζε μυκηλιακές υφές (ελεύθερες ή συσσωματώματα) και συμπαγή μυκήλια. Από τα αποτελέσματα παρατηρήθηκε γραμμική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των μυκηλιακών υφών και της παραγωγής των χρωστικών, ενώ η επίδραση των γαλακτωματοποιητών και της αναλογίας του εμβολίου του μύκητα στη μείωση του μεγέθους των συμπαγών μυκηλίων ήταν καθοριστική. Για την αύξηση της συγκέντρωσης των καροτενίων πραγματοποιήθηκαν πειραματικές δοκιμές σε ζυμωτήρα ανάδευσης και σε βιοαντιδραστήρα στήλης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγκέντρωση των καροτενίων στον ζυμωτήρα ανάδευσης ήταν πολύ μικρή (35,0 mg/g ξηρής βιομάζας). Αντίθετα η επίδραση του ρυθμού παροχής του αέρα στον βιοαντιδραστήρα στήλης αύξησε σημαντικά την παραγωγή των χρωστικών. Η μέγιστη συγκέντρωση των καροτενίων στον βιοαντιδραστήρα στήλης ήταν 222,0 mg/g ξηρής βιομάζας. Επιπρόσθετα πραγματοποιήθηκε ανάλυση των καροτενίων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Τα καροτένια που παράγονται κατά τη ζύμωση του τυρογάλακτος από το μύκητα B. trispora είναι το β-καροτένιο, το γ-καροτένιο και το λυκοπένιο. Το β-καροτένιο αποτελεί το κύριο συστατικό αφού βρίσκεται σε μεγαλύτερη αναλογία σε όλα τα υποστρώματα που μελετήθηκαν. Η αυτόλυση του μύκητα μελετήθηκε σε αποπρωτεϊνομένο - υδρολυμένο τυρόγαλα εμπλουτισμένο με 30 g/l Tween 80, 30 g/l Span 80 και 2 g/l β-ιονόνη σε ανακινούμενες φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα στήλης. Οι κύριοι δείκτες της αυτόλυσης που προσδιορίστηκαν ήταν η συγκέντρωση της ξηρής βιομάζας, των καροτενίων, των υπολειμματικών σακχάρων, το pH του υγρού της ζύμωσης, η συγκέντρωση της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης και τα υδρολυτικά ένζυμα (πρωτεάσες, χιτινάση). Επίσης, μελετήθηκε η μορφολογία του μύκητα κατά τη διάρκεια της αυτόλυσης με το σύστημα ψηφιακής ανάλυσης της εικόνας. Τα στάδια της αυτόλυσης ήταν πιο διακριτά στην περίπτωση του βιοαντιδραστήρα στήλης. Στην περίπτωση αυτή, η κύρια φάση της αυτόλυσης άρχιζε από την 4η ημέρα της ζύμωσης. Στις ανακινούμενες φιάλες παρατηρήθηκε μερική αυτόλυση του μικροοργανισμού από την 2η ημέρα της ζύμωσης η οποία έγινε πιο έντονη τις τελευταίες ημέρες της ζύμωσης. Η αυτόλυση του μύκητα συνδεόταν με την αύξηση της ειδικής δραστικότητας των υδρολυτικών ενζύμων, τη μείωση της συγκέντρωσης της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης και τη μεταβολή των μορφολογικών παραμέτρων του μύκητα