Επίδραση του οξειδωτικού στρες στην παραγωγή κατοτενίων από το μύκητα Blakeslea Trispora σε ζύμωση βυθού

Abstract

In the present study the oxidative stress response of Blakeslea trispora during carotene production from synthetic medium in submerged culture was investigated. The fermentation systems used for the purpose of the present study were shake flask culture, bubble column reactor and stirred tank fermentor. At the first stage of the present study, oxidative stress response and morphological changes of B. trispora induced by butylated hydroxytoluene (BHT) in shake flask culture were investigated. BHT causes morphological changes at the fungus mycelium, so that when BHT is not added in the medium, the microorganism forms large aggregated mycelia but the addition of BHT in the medium causes the formation of smaller aggregates. Small aggregates improve mass transfer characteristics of growth medium and as a result enhanced dissolved oxygen concentration is achieved. The maximum carotene concentration (125 mg/g dry biomass) was produced in culture grown in medium supplemented with 20 mM ΒΗΤ. High dissolved oxygen levels in growth medium resulted in a remarkable increase of the two key defensive enzymes to oxidative stress, SOD and CAT, and the induction of carotenogenesis. At the second stage of the present study, the effect of the ratio Va/Vm (Va is the volume of air over the medium and Vm is the volume of medium in the flask) on carotene production was investigated. The increase of ratio Va/Vm, when BHT was not added in the medium, caused enhancement of dissolved oxygen concentration, increase of SOD and CAT specific activities but decrease of carotene production. The oxidative stress response during carotene production in bubble column reactor was studied in terms of enhanced aeration rate. The highest carotene concentration (55 mg/g dry biomass) was obtained at aeration rate of 4 vvm. At a higher aeration rate (5 vvm) dissolved oxygen concentration was higher than at 4 vvm and carotene production decreased. At lower aeration rate (3 vvm) dissolved oxygen levels remained low and carotene production was decreased. To improve the medium rheology at aeration rate of 4 vvm in the bubble column reactor, alteration of the fungus morphology from loose aggregates to pellets was attempted. The morphological alteration was achieved via the alterations of medium components during sterilization of the medium under strong alkaline conditions. The higher carotene concentration (85 mg/g dry biomass) was correlated with the formation of pellets and mechanical stress resistance. The effect of oxidative stress on carotene production in stirred tank fermentror was studied via enhancement of aeratation rate. The highest carotene concentration was obtained at aeration rate of 1 vvm, while at lower or higher aeration rate levels carotene production was very low. The effect of iron ions as an alternative oxidative stressor was studied in shake flask culture, either at the absence of BHT or in combination with 20 mM BHT. The supplementation of the medium with 1 mM FeCl3 in combination with 20 mM BHT had no effect on the total carotene production but caused changes of carotene composition with a high proportion of γ-carotene.

Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση του οξειδωτικού στρες στην παραγωγή καροτενίων από συνθετικό υπόστρωμα με το μύκητα Blakeslea trispora σε ζύμωση βυθού. Τα συστήματα ζύμωσης τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό της παρούσας έρευνας ήταν το σύστημα ανακινούμενων κωνικών φιαλών σε παλινδρομητή ανακίνησης, ο βιοαντιδραστήρας στήλης και ο ζυμωτήρας ανάδευσης. Στο πρώτο στάδιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της λιπόφιλης αντιοξειδωτικής ουσίας βουτυλοϋδροξυτολουένιο (ΒΗΤ) στην πρόκληση οξειδωτικού στρες και μορφολογικών αλλαγών στο μύκητα B. trispora σε παλινδρομητή ανακίνησης. Το ΒΗΤ προκαλεί μορφολογικές αλλαγές στο μύκητα B. trispora, ώστε ενώ απουσία ΒΗΤ σχηματίζει μεγάλα συσσωματώματα μυκηλιακών υφών, με την προσθήκη ΒΗΤ στο υπόστρωμα ο μικροοργανισμός σχηματίζει μικρότερα συσσωματώματα μυκηλιακών υφών. Η μείωση του μεγέθους των συσσωματωμάτων μυκηλιακών υφών βελτιώνει τα φαινόμενα μεταφοράς μάζας με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύμωσης. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση καροτενίων (125 mg/g ξηρής βιομάζας) παρήχθηκε με την προσθήκη 20 mM ΒΗΤ στο υπόστρωμα. Στο δεύτερο στάδιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση του λόγου Va/Vm (όπου Va ο όγκος του αέρα της φιάλης πάνω από το υπόστρωμα και Vm ο όγκος του υποστρώματος) στην πρόκληση οξειδωτικού στρες στον μύκητα Blakeslea trispora κατά την παραγωγή καροτενίων στον παλινδρομητή ανακίνησης. Η αύξηση του λόγου Va/Vm απουσία ΒΗΤ προκάλεσε αύξηση των επιπέδων διαλυτού οξυγόνου, αύξηση της ειδικής δράσης των αντιοξειδωτικών ενζύμων SOD και CAT, αλλά η παραγωγή καροτενίων μειώθηκε. Η μελέτη του οξειδωτικού στρες στην παραγωγή καροτενίων στο βιοαντιδραστήρα στήλης έγινε μέσω της αύξησης του ρυθμού παροχής του αέρα. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση καροτενίων (55 mg/g ξηρής βιομάζας) παρήχθηκε σε ρυθμό παροχής αέρα 4 vvm. Σε μεγαλύτερο ρυθμό παροχής του αέρα (5 vvm) τα επίπεδα διαλυτού οξυγόνου ήταν μεγαλύτερα σε σχέση με τα 4 vvm και ο μικροοργανισμός παρήγαγε μικρότερη συγκέντρωση καροτενίων. Σε επίπεδα ρυθμού παροχής του αέρα της τάξης των 3 vvm, το διαλυτό οξυγόνου διατηρούνταν σε χαμηλά επίπεδα και η παραγωγή καροτενίων ήταν μικρότερη. Για την επίτευξη καλύτερης ρεολογικής συμπεριφοράς του υποστρώματος σε ρυθμό παροχής του αέρα 4 vvm στο βιοαντιδραστήρα στήλης επιχειρήθηκε η μεταβολή της μορφολογίας του μικροοργανισμού από χαλαρά συσσωματώματα μυκηλιακών υφών σε συμπαγή μυκήλια. Ο τρόπος με τον οποίο επετεύχθη η μορφολογική μεταβολή ήταν με την αποστείρωση του υποστρώματος σε έντονες αλκαλικές συνθήκες (pH 11). Η συμπαγής δομή του μύκητα στο βιοαντιδραστήρα στήλης συσχετίστηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης των καροτενίων σε 85 mg/g ξηρής βιομάζας και την αντοχή στο μηχανικό στρες. Η επίδραση του οξειδωτικού στρες στην παραγωγή καροτενίων στο ζυμωτήρα ανάδευσης μελετήθηκε μέσω την αύξησης του ρυθμού παροχής του αέρα. Σε παροχή αέρα 1 vvm παρατηρήθηκε η μέγιστη παραγωγή καροτενίων, ενώ σε επίπεδα αερισμού χαμηλότερα ή μεγαλύτερα η παραγωγή ήταν πολύ μικρή. Στο σύστημα του παλινδρομητή ανακίνησης μελετήθηκε η επίδραση των ιόντων σιδήρου ως εναλλακτικού τρόπου πρόκλησης οξειδωτικού στρες, είτε απουσία είτε παρουσία 20 mM ΒΗΤ. Η προσθήκη 1 mM FeCl3 στο υπόστρωμα παρουσία 20 mM ΒΗΤ, δε μετέβαλλε τη συγκέντρωση των ολικών καροτενίων, προκάλεσε όμως την αύξηση των ειδικών δράσεων SOD και CAΤ και οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων του γ-καροτενίου.