Μελέτη των μοριακών μηχανισμών πρόκλησης αποπτωτικού θανάτου σε κύτταρα που εκτίθενται σε H2O2: ο ρόλος των ιόντων σιδήρου

Abstract

The ability of iron to exist in various oxidation states (the +2 and +3 valence states are the most important ones) makes it an essential element in many cellular processes associated with basic physiological cell functions. On the other hand, the same high redox potential that enables iron to readily switch between the ferrous and ferric states also makes it potentially toxic. Thus, it is not surprising that nature handles iron with the utmost care and iron homeostasis is carefully regulated by sophisticated mechanisms in order to avoid such injurious interactions. Although iron is usually bound with high affinity to specialized proteins to abrogate the deleterious effects of free iron during oxidative stress, a distinct minor fraction of total cellular iron is thought to be loosely bound to diverse intracellular ligants and serves as a crossroad of cell iron metabolism. This fraction of iron is called redox-active iron and in the presence of H2O2, it catalyzes the generation of the extremely reactive hydroxyl radical (HO.) via the Fenton Reaction. Apart from hydrogen peroxide’s cytotoxic effects, in recent years it has become established that the intracellular redox status play critical roles for the determination of cell “fate” by eliciting a wide variety of cellular responses, such as proliferation, differentiation and apoptosis. Many intracellular signalling pathways involved in ROS induced cellular responses are regulated by the intracellular redox state, which depends on the balance between the levels of oxidizing and reducing equivalents. Although, the role of H2O2 as a messenger in cell signalling is strongly supported by extensive experimental evidence, little information is available regarding the role of iron in such processes. In the present study, we made an efford to investigate if redox-active iron ions play any role in the molecular mechanism of apoptosis-induced by H2O2 and to elucidate the exact chemical reactions that take plays in this process. Among several iron chelators, we selected desferrioxamine (DFO), a membrane-impermeant, strong and rather specific iron chelator, which is taken up by fluid phase endocytosis, thus passing late endosomes before reaching lysosomes and other intracellular compartments. Pre-incubation of cells with DFO resulted in the partial and almost full reduction of the characteristic ladder pattern of oligonucleosomal DNA fragments, as well as in the inhibition of the extrernalization of phosphatidylserine in the outer leaflet of the plasma membrane, indicating the importance of iron ions in the signaling of apoptosis-induced by H2O2. The pathway of the apoptotic procedure was examined step by step, in an effort to indicate the exact point of iron involvement. It was revealed that iron chelation blocked the activation of caspase cascade, the release of cyt-C to the cytosol, the translocation of Bax from cytosol to mitochondria and the phosphorylation of JNK. The observation that iron chelation inhibited the oxidation and sequestration of Trx-1 from the complex of ASK1 (which is the major upstream kinase of JNK activation in the signaling of apoptosis), as well as the oxidation of DUSP1 (which is one of the most well-known tyrosine phosphatases of JNK), revealed that H2O2 requires iron in order to induce such oxidations. Thereafter, the data presented here indicate that iron-mediated oxidations of specific cysteine residues may represent a common mechanism through which H2O2 exerts its second-messenger role in the signal transduction pathway of apoptosis. Whether this is an isolated observation or it represents a generalized phenomenon dictating H2O2-induced oxidations of sulfhydryl groups remains to be explored.

Η ιδιότητα των ιόντων σιδήρου να αλλάζουν την οξειδοαναγωγική τους κατάσταση είναι ένα γεγονός που τους προσδίδει από τη μία πλευρά μία προνομιακή θέση στη ζώσα ύλη αλλά από την άλλη τα καθιστά πιθανές πηγές κινδύνου. Για τον λόγο αυτό, η φύση έχει προβλέψει ούτως ώστε το μεγαλύτερο μέρος του ενδοκυττάριου σιδήρου να βρίσκεται στενά συνδεδεμένο σε πρωτεΐνες με τέτοιον τρόπο ώστε να αποφεύγεται η αντίδρασή του με το Η2Ο2. Εντούτοις, ένα μικρό μέρος του σιδήρου θεωρείται ότι ευρίσκεται στα κύτταρα χαλαρά συνδεδεμένο σε διάφορα ενδοκυττάρια μόρια και είναι άμεσα διαθέσιμο στο κύτταρο για την κάλυψη των αναγκών του. Το μέρος αυτό του σιδήρου καλείται ‘‘οξειδοαναγωγικά ενεργός σίδηρος’’ και θεωρείται ικανό να αντιδρά με Η2Ο2 με συνέπεια τη δημιουργία των εξαιρετικά δραστικών ριζών υδροξυλίου (.ΟΗ), οι οποίες δεν προλαβαίνουν να διαχυθούν αλλά αντιδρούν ακαριαία και οξειδώνουν όλα τα κυτταρικά συστατικά. Πέρα όμως από την τοξική δράση που παρουσιάζει το Η2Ο2, τα τελευταία χρόνια έχει γίνει κατανοητό ότι η ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική κατάσταση αποτελεί το βασικό ρυθμιστή της «τύχης» του κυττάρου καθώς αλλαγές στην οξειδοαναγωγική ισορροπία μπορούν να επηρεάσουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Ωστόσο, αν και ο ρόλος του H2O2 ως δεύτερου διαμεσολαβητή έχει μελετηθεί εκτενώς και είναι κοινώς αποδεκτό ότι παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση πολλών κυτταρικών διεργασιών, από την άλλη πλευρά, ελάχιστες είναι μέχρι στιγμής οι διαθέσιμες αναφορές πάνω στο ρόλο (αν υπάρχει κάποιος), που πιθανώς να διαδραματίζουν τα οξειδοαναγωγικά ενεργά ιόντα σιδήρου στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς που εμπλέκεται το Η2Ο2. Στην παρούσα εργασία έγινε μια προσπάθεια να διερευνηθεί αν τα ιόντα σιδήρου εμπλέκονται στη μεταγωγή του σήματος στην απόπτωση που προκαλείται από το Η2Ο2 και να διαλευκανθεί σε ποιο σημείο της αποπτωτικής διαδικασίας αλλά και με ποιον τρόπο τα ιόντα σιδήρου μπορούν να επηρεάσουν αυτή τη διεργασία. Για τη δέσμευση του σιδήρου έγινε χρήση μια ευρέως χρησιμοποιούμενης στην κλινική πράξη σιδηροδεσμευτικής ένωσης, της δεσφεριοξαμίνης, η οποία δε μπορεί να διαπερνά τις κυτταρικές μεμβράνες αλλά προσλαμβάνεται από τα κύτταρα με ενδοκύττωση και μέσω των ενδοσωματίων καταλήγει στα λυσοσωμάτια και πιθανά και σε άλλα ενδοκυττάρια διαμερίσματα. Στα πρώτα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, παρατηρήθηκε ότι η απομάκρυνση του σιδήρου μέσω προ-επώασης των κυττάρων με δεσφεριοξαμίνη ανέστειλε σε σημαντικό βαθμό τη δημιουργία ενδονουκλεοσωμικών σχάσεων στο DNA των κυττάρων αλλά και την εξωτερίκευση της φωσφατιδιλοσερινης στην εξωτερική πλευρά της κυτταροπλασματικής μεμβράνης υποδηλώνοντας τη σπουδαιότητα των ιόντων σιδήρου στον καταρράκτη της αποπτωτικής διαδικασία.