Ο ρόλος των ελεύθερων λιπαρών οξέων και του οξειδωτικού στρες στην ανάπτυξη μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας

Abstract

Inappropriate accumulation of excess lipids into liver cells, in the form of lipid droplets, has been proposed to lead to dysfunction of hepatocytes and, consequently, to serious pathological complications (lipotoxicity). Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a term used to characterize a spectrum of pathological changes ranging from simple fatty infiltration (steatosis) to hepatic steatosis accompanied with inflammation, fibrosis, and cirrhosis (non-alcoholic steatohepatitis, NASH). Despite the high prevalence of NAFLD and its potential for serious complications, the underlying molecular mechanisms that determine the progression to liver damage remain poorly understood and need further investigation. The aim of the present study was to create a model of the two hit hypothesis, using human hepatocytes in culture, in order to investigate the role of free fatty acids and oxidative stess in the process of lipotoxicity. In detail, HepG2 human liver cells were exposed to stearate, oleate, or mixtures of the two fatty acids and the effects on cell proliferation and viability, reactive oxygen species (ROS) generation, induction of ER stress and apoptosis and lipid droplet accumulation, were evaluated. It was observed that: a) stearate, but not oleate, inhibited cell proliferation and induced cell death, b) stearate-induced cell death had the characteristics of ER stress- and mitochondrial-mediated apoptosis, c) stearate-treated cells did not produce ROS and untreated and fatty acid-treated cells were equally sensitive against DNA damage, induced by subsequent exposure to hydrogen peroxide, d) the capacity of cells to produce and accumulate triglycerides in the form of lipid droplets was hindered at an early phase following exposure to stearate, while it proceeded normally in oleate-treated cells, e) Co-administration of oleate restored the ability of stearate-treated cells for triglyceride synthesis and lipid droplet formation and protected cells from stearate-induced toxicity at all steps, e) activation of stearate, in the form of stearoyl-CoA, was a necessary step for the manifestation of toxicity. Collectively, the data suggest that oxidative stress does not represent a significant contributor in saturated fatty acid-induced liver toxicity. The results indicate that it is not free stearate per se, but one or more of its specific metabolic products, with different properties than oleate metabolites, which are responsible for inducing cell toxicity. It is proposed that these saturated lipid intermediates of stearate hinder and then interrupt the process of triglyceride synthesis in endoplasmic reticulum (ER) membranes and induce ER stress, leading ultimately in mitochondrial-mediated apoptotic cell death. Co-administration of oleate appears to modulate the physical properties of these metabolites, inhibiting in this way their toxic effect. In conclusion, it is suggested that interruption of triglyceride synthesis constitutes the key initiating event, in the process of saturated fatty acid-induced lipotoxicity

Η συνεχής συσσώρευση λιπιδίων στη μορφή σταγονιδίων λίπους έχει προταθεί ότι οδηγεί σε δυσλειτουργία των ηπατοκυττάρων με επακόλουθο την εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων (λιποτοξικότητα). Ο όρος μη-αλκοολική λιπώδης εκφύλιση του ήπατος (Non Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD), χρησιμοποιείται για την περιγραφή ενός φάσματος τέτοιων καταστάσεων και περιλαμβάνει την πορεία εξέλιξης, από την απλή δημιουργία του λιπώδους ήπατος στην ανάπτυξη πιο σοβαρών σταδίων, όπως η στεατοηπατίδα (Non Alcoholic Steatohepatitis, NASH), η κίρρωση ακόμα και η καρκινογένεση. Παρά τη μεγάλη επικράτηση της NAFLD και τις επιπτώσεις της στην παγκόσμια υγεία, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί, υπεύθυνοι για την ανάπτυξη της ασθένειας, δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως και χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μεταφορά της υπόθεσης των δύο χτυπημάτων σε μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας, με σκοπό τη μελέτη του ρόλου των ελεύθερων λιπαρών οξέων και του οξειδωτικού στρες στον μηχανισμό πρόκλησης λιποτοξικότητας. Πιο συγκεκριμένα, ανθρώπινα ηπατοκύτταρα HepG2 εκτέθηκαν σε κορεσμένο στεατικό οξύ (18:0), μονοακόρεστο ελαϊκό οξύ (18:1, cis) καθώς και σε συνδυασμούς των δύο λιπαρών οξέων και μελετήθηκε λεπτομερώς, η επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των κυττάρων, στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου, στη δημιουργία στρες ενδοπλασματικού δικτύου και απόπτωσης και στην παραγωγή και συσσώρευση σταγονιδίων λίπους. Παρατηρήθηκε ότι: α) το στεατικό οξύ, και όχι το ελαϊκό, ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προκάλεσε το θάνατο των ηπατοκυττάρων, β) ο επαγόμενος κυτταρικός θάνατος παρουσίασε χαρακτηριστικά ανάπτυξης στρες ενδοπλασματικού δικτύου και μιτοχονδριακού αποπτωτικού θανάτου, γ) η έκθεση σε στεατικό οξύ δεν οδήγησε στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου, ούτε αύξησε την ευαισθησία του DNA των κυττάρων στην εξωγενή προσθήκη υπεροξειδίου του υδρογόνου, δ) η σύνθεση και συσσώρευση σταγονιδίων λίπους διακόπηκε από τα πρώτα στάδια έκθεσης σε στεατικό οξύ, ενώ η διαδικασία αυτή συνεχίστηκε κανονικά στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε ελαϊκό οξύ, ε) η ταυτόχρονη προσθήκη ελαϊκού οξέος ανέστηλε πλήρως την τοξική δράση του κορεσμένου λιπαρού οξέος σε όλα τα στάδια που μελετήθηκαν και επανέφερε την ικανότητα σύνθεσης τριγλυκεριδίων και παραγωγής σταγονιδίων λίπους, στ) η ενεργοποίηση του ελεύθερου στεατικού οξέος με το συνένζυμο Α αποτέλεσε απαραίτητη προϋπόθεση για την εκδήλωση της τοξικής δράσης. Συγκεντρωτικά φαίνεται ότι το οξειδωτικό στρες δεν διαδραματίζει κάποιο σημαντικό ρόλο στην λιποτοξική δράση του κορεσμένου λιπαρού οξέος. Τα αποτελέσματα επιδεικνύουν καθαρά, πως το ελεύθερο στεατικό οξύ δεν είναι υπεύθυνο για την πρόκληση τοξικότητας αλλά κάποιο μεταβολικό του προϊόν, που φέρει διαφορετικές ιδιότητες από τους αντίστοιχους μεταβολίτες του ελαϊκου οξέος. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι κορεσμένοι ενδιάμεσοι μεταβολίτες του στεατικού οξέος εμποδίζουν και διακόπτουν τη φυσιολογική πορεία σύνθεσης τριγλυκεριδίων, στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου και προκαλούν στρες στο οργανίδιο αυτό, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού αποπτωτικού μονοπατιού. Ταυτόχρονη προσθήκη ελαϊκού οξέος φαίνεται να ρυθμίζει άμεσα ή έμμεσα τις ιδιότητες των μεταβολιτών αυτών, αναστέλλοντας έτσι την τοξική τους δράση. Συμπερασματικά προτείνεται ότι, η αναστολή της σύνθεσης τριγλυκεριδίων αποτελεί το κομβικό εναρκτήριο γεγονός της λιποτοξικής δράσης του κορεσμένου στεατικού οξέος