Βιοχημική ανάλυση και περιβαλλοντικές εφαρμογές βακτηρίων που αποδομούν πετρελαϊκά κατάλοιπα

Abstract

A bacterial stain, Spet, was isolated from a Greek petroleum polluted soil, near Athens, using petroleum as sole carbon and energy source and it was taxonomically identified as closest to Pseudomonas aeruginosa based on 16S rDNA sequence, G+C content, fatty acids analysis and several biochemical assays. Strain Spyr1 isolated from a Greek creosote polluted soil using pyrene as sole carbon and energy source was found to belong to Mycobacterium sp. based on 16S rDNA gene sequence analysis. Spyr1, exhibited a very broad substrate profile, being able to utilize anthracene, phenanthrene, fluorine, fluoranthene and pyrene as sole carbon and energy source. For soil biodegradation studies four different types of soil were used: a non-polluted spiked soil, a heavily polluted soil, an aged polluted soil and a non-polluted spiked soil that was left to age for six months. Spyr1 and Spet cells acclimated to grow in petroleum and pyrene as the sole carbon and energy source were immobilized in three different materials: Alumina pellets, Macroporous sinter glass SiranR, and an alginate/starch mixture. Alumina was disintegrated during biodegradation studies in liquid cultures. Both freely suspended and immobilized Spyr1 cells on porous glass beads showed the same degradation ability in liquid suspensions whereas only about 58% was removed in soil microcosms using immobilized cells. Alginate/starch entrapped cells have given good yields in the removal of pyrene as well as mixture of PAHs. Pyrene degradation by entrapped cells in liquid cultures and in soil was complete within 12 days and 17 days, while pyrene degradation by free cells occurred within 12 and 14 days, respectively. Phenathrene was degraded completely after 14 days of incubation while 4% pyrene and 2% fluoranthene persisted after 23 days of incubation with free cells. After 23 days of incubation with entrapped cells, 2% phenathrene, 10% pyrene and 8% fluoranthene remained in the soil. The biodegradation of petroleum in liquid cultures and soil was monitored using free and immobilized Spet cells. Petroleum degradation by free and alginate/starch entrapped cells in liquid cultures and in soil after 21 days resulted to 60% degradation, respectively. 60% and 31% petroleum was degraded in liquid cultures and in soil using Siran immobilized Spet cells, respectively.

Για τη μελέτη της βιοεξυγίανσης ρυπασμένων από πετρελαιοειδή εδαφών, απομονώθηκε με την μέθοδο του εμπλουτισμού ένα βακτηριακό στέλεχος, Spet, το οποίο χρησιμοποιεί πετρέλαιο ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας. Κύτταρα Spet αποδομούν επίσης πετρέλαιο κίνησης και πίσσα, αναπτύσσονται σε ευρύ φάσμα n-αλκανίων C5-C28 με ιδιαίτερη προτίμηση σε αλκάνια μεσαίας αλυσίδας. Η ταυτοποίηση του στελέχους έγινε με μελέτη των μορφολογικών χαρακτηριστικών του, μικροβιολογικό και βιοχημικό χαρακτηρισμό, λιπιδιακή ανάλυση και ανάλυση των ισοπρενοειδών κινονών καθώς και μελέτη του γονιδιώματός του με προσδιορισμό της περιεκτικότητας % G+C και ανάλυση της αλληλουχίας 16S rRNA. Το στέλεχος Spet ανήκει στο γένος Pseudomonas sp. με συγγενέστερο είδος το Pseudomonas aeruginosa. Το στέλεχος Spet εμφανίζει μεγάλη ανθεκτικότητα σε ευρύ φάσμα αντιβιοτικών, εμφανίζει κίνηση, σχηματίζει βιοφιλμ και παράγει ραμνολιπίδια. Στο στέλεχος Spet ανιχνεύθηκαν γονίδια που κωδικεύουν υδροξυλάσες που συμμετέχουν στην αποδόμηση των αλκανίων. Η ανίχνευση έγινε ύστερα από την ενίσχυση με PCR των αλληλουχιών των γονιδίων των υδροξυλασών alkB1 και alkB2 χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους εκκινητές. Ακολούθησαν πειράματα αποδόμησης PAHs από τους μικροοργανισμούς Spyr1, Spyr2, Spyr3, Sphe3, Sflu4, Sflu5 και Ophe1 και πετρελαίου από το στέλεχος Spet α) σε τεχνητά ρυπασμένο χώμα, β) σε παλαιά ρυπασμένο χώμα, γ) σε πιο πρόσφατα και ιδιαίτερα ρυπασμένο χώμα και δ) σε τεχνητά ρυπασμένο χώμα το οποίο είχε αφεθεί να παλαιώσει για 6 μήνες στο εξωτερικό περιβάλλον. Διαπιστώθηκε ότι (i) μίγματα μικροοργανισμών και μίγματα υποστρωμάτων δρουν συνεργιστικά, (ii) ο χρόνος επαφής χώματος-υποστρώματος επηρεάζει αρνητικά την αποδόμηση και (iii) η προσθήκη μικροοργανισμών (βιοενίσχυση) με την ταυτόχρονη προσθήκη θρεπτικών συστατικών (βιοδιέγερση) ήταν πιο αποτελεσματική στην αποδόμηση των ρυπογόνων ενώσεων. Το στέλεχος Spet απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε στην παρούσα εργασία. Τα στελέχη Spyr1, Spyr2, Spyr3, Sphe3, Sflu4 και Sflu5 απομονώθηκαν με την μέθοδο του εμπλουτισμού από έδαφος ρυπασμένο με κρεοζωτέλαιο που προέρχεται από τις εγκαταστάσεις του εργοστάσιου κατεργασίας ξύλου ΕΛΒΙΕΞ στην περιοχή Ιωαννίνων - Κόνιτσας χρησιμοποιώντας αντίστοιχα πυρένιο για τα τρία πρώτα, φαινανθρένιο, και φλουορανθένιο για τα δύο τελευταία ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας (Καλλιμάνης Αριστείδης, διδακτορική διατριβή 2004). Το βακτηριακό