Μελέτη των μοριακών και βιοχημικών μηχανισμών προσαρμογής των μικροφυκών σε αβιοτικές καταπονήσεις

Abstract

Microalgae are ubiquitous in aquatic environments, and they frequently encounter oxidative stress in their natural habitats, prompting the development of species-specific adaptation mechanisms. Understanding these mechanisms can offer valuable insights for biotechnological applications in microalgae metabolic manipulation. In the present study, we conducted a global multi-omics analysis, encompassing RNAseq, GC-MS, and GC-FID, to uncover the adaptation mechanisms of three microalgal species: Tetraselmis chuii, Chlorella variabilis, and Chlamydomonas reinhardtii. Exposure to 0.5-mM H2O2 resulted in reduced cell viability in T. chuii, an industrially significant microalga, with higher concentrations causing a drastic decline. After 1 hour of H2O2 exposure, the photosynthetic capacity (Qy) was negatively impacted, and this reduction intensified after 6 hours of continuous stress. However, T. chuii exhibited a rapid response to H2O2-induced oxidative stress within the first hour, leading to significant changes in both transcriptomic and metabolomic profiles. Carbon and energy flow were among the cellular functions adversely affected, with photosynthesis-related psbQ downregulated by 2.4-fold, pyruvate kinase decreasing by 1.5-fold, and urea content reduced by 3-fold. Extended exposure to H2O2 imposed a high energy cost, hampering efforts to enhance carbon metabolism, as evidenced by the upregulation of photosystems-related PetC and PetJ by more than 2-fold. These findings indicate that while T. chuii rapidly responds to oxidative stress, prolonged exposure can have detrimental effects on its cellular functions. Similarly, exposure of C. variabilis to 2-mM H2O2-induced oxidative stress for 1 hour resulted in decreased cell viability and photosynthetic capacity. Transcriptomic and metabolomic profiles were also affected as an attempt to maintain cellular homeostasis. Extended exposure for 6 hours had a substantial impact on C. variabilis cells. The model-organism C. reinhardtii was utilized to conduct an in-depth analysis of the role of CrSBD1, an SBP homologue, in the response to oxidative stress. Selenium-binding proteins (SBPs) represent a widely distributed protein family implicated in various environmental stress responses, although their exact molecular and physiological roles remain elusive. Growth analysis of the C. reinhardtii sbd1 mutant strain revealed that the absence of functional CrSBD1 resulted in increased growth under mild oxidative stress conditions, although cell viability rapidly declined at higher H2O2 concentrations. Furthermore, the sbd1 mutant exhibited a significant reduction in molecular and biochemical responses to H2O2-induced oxidative stress compared to the wild type. This study suggests that CrSBD1 plays a novel role in regulating early responses to oxidative stress in C. reinhardtii. Overall, the present PhD thesis investigates the oxidative stress responses of three distinct microalgal species, aiming to elucidate their diversity. The findings underscore the potential for leveraging oxidative stress to manipulate the metabolism of microalgae with the goal of enhancing the production of specific metabolites.

Τα μικροφύκη συναντώνται σε όλα τα υδάτινα περιβάλλοντα του πλανήτη και συχνά αντιμετωπίζουν συνθήκες οξειδωτικής καταπόνησης στα φυσικά ενδιαιτήματα τους. Για το λόγο αυτό έχουν αναπτύξει κατάλληλους μηχανισμούς προσαρμογής στις οξειδωτικές συνθήκες, οι οποίοι σε πολλές περιπτώσεις είναι μοναδικοί για κάθε είδος. Η μελέτη και κατανόηση τους μπορεί να προσφέρει πολύτιμες γνώσεις για την αξιοποίηση τους στο μεταβολικό χειρισμό των μικροφυκών. Στην παρούσα διατριβή, αξιοποιήθηκαν -ομικές τεχνολογίες, συμπεριλαμβανομένων των RNAseq, GC-MS και GC-FID, προκειμένου να διερευνηθούν οι μηχανισμοί προσαρμογής τριών ειδών μικροφυκών, των Tetraselmis chuii, Chlorella variabilis και Chlamydomonas reinhardtii. Η έκθεση του T. chuii σε 0.5-mM H2O2 οδήγησε σε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ η εφαρμογή υψηλότερων συγκεντρώσεων προκάλεσε δραστική μείωση. Επίσης, μετά από 1 ώρα έκθεσης η φωτοσυνθετική ικανότητα (Qy) επηρεάστηκε αρνητικά και η μείωση εντάθηκε μετά από 6 ώρες συνεχούς καταπόνησης. Ωστόσο, το T. chuii εμφάνισε ταχεία απόκριση στην επαγόμενη από H2O2 οξειδωτική καταπόνηση, οδηγώντας σε σημαντικές τροποποιήσεις στο μεταγραφομικό και μεταβολομικό προφίλ του εντός της πρώτης ώρας. Η ροή άνθρακα και ενέργειας ήταν μεταξύ των κυτταρικών λειτουργιών που επηρεάστηκαν δυσμενώς, με το γονίδιο psbQ που σχετίζεται με τη φωτοσύνθεση να μειώνει την έκφραση του κατά 2.4 φορές, την πυροσταφυλική κινάση να μειώνεται 1.5 φορά και την περιεκτικότητα σε ουρία να μειώνεται 3 φορές. Η παρατεταμένη έκθεση σε H2O2 είχε υψηλό ενεργειακό κόστος, παρεμποδίζοντας τις προσπάθειες για την ενίσχυση του μεταβολισμού του άνθρακα, όπως υποδεικνύεται από την αύξηση της έκφρασης των PetC και PetJ που σχετίζονται με τα φωτοσυστήματα κατά περισσότερο από 2 φορές. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, ενώ το T. chuii ανταποκρίνεται γρήγορα στην οξειδωτική καταπόνηση, η παρατεταμένη έκθεση μπορεί να έχει επιζήμια αποτελέσματα στις κυτταρικές του λειτουργίες. Παρόμοια εικόνα εμφάνισε και το μικροφύκος C. variabilis, για το οποίο ωστόσο χρειάστηκε εφαρμογή 2-mM H2O2 για την επαγωγή της καταπόνησης. Έκθεση του συγκεκριμένου μικροφύκους στην καταπόνηση για 1 ώρα οδήγησε σε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και πτώση της φωτοσυνθετικής ικανότητας. Τα μεταγραφομικά και μεταβολομικά προφίλ επηρεάστηκαν επίσης, σε μια προσπάθεια διατήρησης της κυτταρικής ομοιόστασης. Η παρατεταμένη έκθεση των καλλιεργειών σε Η2Ο2 για 6 ώρες είχε σημαντικά αρνητική επίδραση στα κύτταρα του C. variabilis. Το μικροφύκος-μοντέλο C. reinhardtii χρησιμοποιήθηκε για την πραγματοποίηση μιας ανάλυσης σε βάθος του ρόλου του CrSBD1, ενός ομόλογου γονιδίου της SBP, στην απόκριση στην οξειδωτική καταπόνηση. Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν το σελήνιο (SBPs) αντιπροσωπεύουν μια ευρέως διαδεδομένη οικογένεια πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε διάφορες αποκρίσεις σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις, αν και ο ακριβής μοριακός και φυσιολογικός ρόλος τους παραμένει αδιευκρίνιστος. Η ανάλυση ανάπτυξης του μεταλλαγμένου στελέχους C. reinhardtii sbd1 αποκάλυψε ότι η απουσία λειτουργικού CrSBD1 είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη βιωσιμότητα υπό ήπιες συνθήκες οξειδωτικής καταπόνησης, η οποία μειώθηκε ταχύτατα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις H2O2. Επιπλέον, το μετάλλαγμα sbd1 εμφάνισε σημαντικά μειωμένες μοριακές και βιοχημικές τροποποιήσεις ως αποκρίσεις στην οξειδωτική καταπόνηση, σε σύγκριση με το στέλεχος φυσικού τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το CrSBD1 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των πρώιμων αποκρίσεων του C. reinhardtii στην οξειδωτική καταπόνηση. Συνολικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή μελετά τις αποκρίσεις στην οξειδωτική καταπόνηση τριών διαφορετικών ειδών μικροφυκών σε μια προσπάθεια να προσεγγίσει την ποικιλότητα τους. Από τα αποτελέσματα υπογραμμίζεται η δυνατότητα αξιοποίησης της οξειδωτικής καταπόνησης για το μεταβολικό χειρισμό των μικροφυκών προς την αύξηση της έκφρασης συγκεκριμένων μονοπατιών και την παραγωγή συγκεκριμένων μεταβολιτών.