Μοριακή μελέτη των μικρών ανευρυσμάτων κοιλιακής αορτής και αναζήτηση βιοδεικτών για την ανευρυσματική νόσο της κοιλιακής αορτής

Abstract

Background: Small abdominal aortic aneurysms pose a latent threat as there is a risk of rupture if left undetected. Currently, the diagnosis of abdominal aortic aneurysms is based on radiologic methods and there is a lack of alternative modalities in clinical practice. MicroRNAs have emerged as promising biomarkers, having established their efficacy in identifying various pathologies, including aortic aneurysms. Scope: The main aim of this study was to identify microRNAs with differential expression in the serum of patients with small abdominal aortic aneurysms and create a signature panel. Additionally, to validate the expression of one of the microRNAs, as a potential biomarker. Methods: The initial stage of screening for miRNAs with differential diagnosis was performed with Next-Generation Sequencing in 3 groups of samples (9 in total, 3 of each group), small abdominal aortic aneurysms compared with large aneurysms and control samples. For the second stage, miR-24 was chosen for validation of its expression levels in a larger number of samples (n=80), by Real– Time PCR. Results: Twenty-three microRNAs, with significant differential expression in small abdominal aortic aneurysms, were identified in the Next-Generation Sequencing analysis. MiR-24 showed the largest up-regulation by 23-fold (log2FC 4.5, p= 0.024). For large aneurysms compared with controls and for small versus large aneurysms, 33 and 131 microRNAs with differential expression were identified, respectively. By further analysis, 17 microRNAs were common in comparisons between the 3 groups: miR-3194 miR-3195, miR-7846, miR-486-2, miR-3178, miR-1538, miR-5589, miR-1908, miR-6504, miR-3159, miR-4771-1, miR-5695, miR-6823, miR-496, miR-193a,miR-7853 and miR-23a. In the validation stage with Real – time PCR, miR-24 was found down-regulated in the plasma of patients with abdominal aortic aneurysms (small and large) compared with healthy donors: 0.27 fold-change (p= 0.015) for small and 0.15 (p=0.005) for large aneurysms. Lastly, no correlation between Real – time PCR Ct values and aneurysm diameter or patient age was found. Conclusion: The present study underscores the potential of miR-24 as a biomarker for small abdominal aortic aneurysms as well as a possible therapeutic target. Further research is warranted to identify more disease-specific microRNAs, for discriminating between diseases with similar pathogenetic mechanisms.

Εισαγωγή: Τα μικρά ανευρύσματα κοιλιακής αορτής είναι συνήθως ασυμπτωματικά και ανιχνεύονται ως τυχαίο εύρημα σε απεικονιστικούς ελέγχους για διερεύνηση άλλων παθολογιών. Επί του παρόντος, η διάγνωση της ανευρυσματικής νόσου γίνεται με απεικονιστικές μεθόδους. Η ανάδειξη βιοδεικτών αποτελεί ένα επιπλέον βήμα προς την έγκαιρη διάγνωση, πριν την εμφάνιση επιπλοκών όπως η ρήξη, που είναι δυνητικά θανατηφόρα. Τα microRNA έχουν αποδειχτεί καλής ποιότητας βιοδείκτες για μεγάλο αριθμό παθολογιών, συμπεριλαμβανομένων και των ανευρυσμάτων κοιλιακής αορτής. Σκοπός:Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν, μέσω της ανίχνευσης microRNA με διαφορική έκφραση στα μικρά ανευρύσματα κοιλιακής αορτής, να δημιουργηθεί μια εν δυνάμει αντιπροσωπευτική ομάδα microRNA καθώς και η περαιτέρω επαλήθευση της έκφρασης ενός εξ’αυτών, ως πιθανό βιοδείκτη, στον ορό ασθενών. Μέθοδοι: Το αρχικό στάδιο ανίχνευσης της διαφορικής έκφρασης των microRNA πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο Next-Generation Sequencing σε τρεις ομάδες δειγμάτων (9 στοσύνολο, 3 από κάθε ομάδα), τα μικρά ανευρύσματα κοιλιακής αορτής συγκριτικά με μεγάλα ανευρύσματα, και τα δείγματα ελέγχου. Για το δεύτερο στάδιο, επιλέχθηκε το miR-24, για επαλήθευση της έκφρασης του με τη μέθοδο Real – time PCR σε μεγαλύτερη ομάδα δειγμάτων (n=80). Αποτελέσματα: Από τη μέθοδο Next-Generation Sequencing, ταυτοποιήθηκαν 23 microRNA μεστατιστικά σημαντική διαφορική έκφραση στα μικρά ανευρύσματα κοιλιακής αορτής. Το miR-24 παρουσίασε τη μεγαλύτερη υπερ-έκφραση, κατά 23 φορές (log2FC 4,5, p= 0,024). Για τα μεγάλα ανευρύσματα κοιλιακής αορτής, συγκριτικά με τα δείγματα ελέγχου καθώς και για τα μικρά συγκριτικά με τα μεγάλα ανευρύσματα, ταυτοποιήθηκαν 33 και 131 microRNA αντίστοιχα, με στατιστικά σημαντική διαφορική έκφραση. Σε περαιτέρω ανάλυση, ανευρέθηκαν 17 microRNA τα οποία ήταν κοινά στις συγκρίσεις της διαφορικής έκφρασης ανάμεσα στις 3 ομάδες: miR-3194 miR-3195, miR-7846, miR-486-2, miR-3178, miR-1538, miR-5589, miR-1908, miR-6504, miR-3159,miR-4771-1, miR-5695, miR-6823, miR-496, miR-193a, miR-7853 και miR-23a. Στο στάδιο της επαλήθευσης με Real – time PCR, αναδείχθηκε μειωμένη έκφραση του miR-24 στο πλάσμα ασθενών με ανευρύσματα κοιλιακής αορτής (μικρά και μεγάλα) συγκριτικά με υγιείς εθελοντές: 0.27 fold-change (p= 0,015) για τα μικρά και 0.15 (p=0,005) για τα μεγάλα ανευρύσματα. Τέλος, δεν ανευρέθηκε συσχέτιση μεταξύ των τιμών Ct από τη Real – Time PCR και τη διάμετρο του ανευρύσματος ή την ηλικία των ασθενών. Συμπέρασμα: Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης αναδεικνύουν τη σημαντικότητα του miR-24ως πιθανό βιοδείκτη για τη διάγνωση των μικρών ανευρυσμάτων κοιλιακής αορτής αλλά και ως πιθανό θεραπευτικό στόχο. Περαιτέρω ανάλυση και ταυτοποίηση περισσότερων microRNA, ειδικών για την ανευρυσματική νόσο, είναι καίριας σημασίας για τη διαφοροποίηση μεταξύ παθολογιών με παρόμοιους παθογενετικούς μηχανισμούς.