Διατροφική αξιολόγηση και βιολειτουργικές ιδιότητες εδώδιμων μανιταριών που αναπτύχθηκαν σε υποστρώματα εμπλουτισμένα με γεωργικά υποπροϊόντα

Abstract

Wine and olive oil production are amongst the major agricultural activities in the Mediterranean region, generating big volumes of wastes and by-products. Within the concept of recycling and sustainability, several attempts have been made to exploit these wastes for the production of value-added products, like mushrooms. Mushrooms’ production and consumption and production is constantly increasing, due to their health benefits and organoleptic characteristics, with Pleurotus species being widely commercialized worldwide. In this work we investigated the inuence of endogenous (genetic, species) and exogenous (cultivation substrates) factors on the profiles of free amino acids (FAAs) and volatile aroma compounds in three Pleurotus species, namely P. ostreatus, P. eryngii and P. nebrodensis, cultivated on wheat straw (control), grape marc, olive leaves and two-phase olive mill wastes, in mixtures or separately. Subsequently, an attempt was made to verify the discrimination based on these compounds. The FAAs profile was obtained by employing the EZ:faast™ kit for GC-MS provided by Phenomenex. Volatiles were extracted from fresh mushrooms with headspace solid phase microextraction (HS-SPME) and analysed by GC-MS. The same analytical scheme was applied to assess the inuence of cooking (roasting) on volatiles’ proles. Moreover, the implementation of NMR and FT-IR spectroscopies was used in order to identify the groups and the compounds that shape the total metabolic profile of these mushrooms, especially for P. nebrodensis for which relative literature is scarce.Overall, 22 FAAs were determined in substrates and mushrooms, including all the essential amino acids, the neurotransmitter γ-aminobutyric acid (GABA) and ornithine. On a dry weight (d.w.) basis, total FAAs ranged from 17.37 mg/g in P. nebrodensis to 130.12 mg/g in P. ostreatus samples, with alanine, leucine, glutamine, valine and serine predominating. Similar distribution patterns were followed by the monosodium glutamate (MSG)-like, sweet and bitter FAAs. Signicant dierences in FAAs levels were observed among the species examined and among the cultivation substrates used. Principal Component Analysis (PCA) performed on the entire FAAs prole of the Pleurotus strains, clearly separated P. ostreatus from P. eryngii and P. nebrodensis, in accordance to their phylogenetic anity. Concerning the volatile aroma profile, more than 50 compounds were determined in fresh mushroom samples, with P. ostreatus presenting higher concentrations but a lower number of volatile compounds compared to P. eryngii. Roasting resulted in partial elimination of volatiles and the formation of new compounds (pyrazines, Strecker aldehydes and sulphur compounds). Principal component analysis on the data obtained succeeded to discriminate among raw and cooked mushrooms as well as among Pleurotus species and strains, but not among different cultivation substrates. Ketones, alcohols and toluene were mainly responsible for discriminating among P. ostreatus strains while aldehydes and fatty acid methyl esters contributed more at discriminating P. eryngii strains. For the total metabolic profile, the 1D NOESY-PRESAT pulse sequence was utilized and achieved the identification of 91 metabolites, with 23 of them detected in P. nebrodensis only. Metabolites such as free amino acids, carbohydrates, nucleotides, and organic acids were correlated with the clustering of samples. The application of FT-IR spectroscopy indicated changes in the spectra obtained according to the substrate used. For instance, spectra of mushrooms cultivated on substrates containing olive mills by-products revealed stronger absorption intensities in regions related to aromatic compounds (e.g., phenolics), while those cultivated on wheat- straw and grape marc in regions related to carbohydrates. PCA in the obtained FT-IR spectra differentiated the samples according to species, and highlighted information related to cultivation substrates. In conclusion, the three Pleurotus species were not affected dramatically by the cultivation substrate, as far individual groups such as FAAs and volatile aroma compounds are concerned. This indicates that the endogenous factors may be stronger than the exogenous ones. On the other hand, the untargeted analysis demonstrated that the three Pleurotus species responded in a different manner by selectively absorbing organic compounds, producing value-added mushrooms. This is the first time that the aforementioned analyses were carried out in the critically endangered P. nebrodensis.

Η παραγωγή κρασιού και ελαιόλαδου συγκαταλέγεται στις κυριότερες γεωργικές δραστηριότητες στην περιοχή της Μεσογείου, παράγοντας μεγάλους όγκους αποβλήτων και παραπροϊόντων. Στα πλαίσια της ανακύκλωσης και της βιωσιμότητας, έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες εκμετάλλευσης αυτών των παραπροϊόντων για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, όπως τα μανιτάρια. Η παραγωγή και η κατανάλωση των μανιταριών αυξάνεται συνεχώς τις τελευταίες δεκαετίες χάρη στις ευεργετικές ιδιότητες τους για την υγεία και στα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά, με τα είδη Pleurotus να είναι από τα πιο εμπορικά παγκοσμίως. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση τριών ειδών Pleurotus, (P. ostreatus, P. eryngii και P. nebrodensis), που καλλιεργήθηκαν σε άχυρο σιταριού (μάρτυρας), στέμφυλα, φύλλα ελιάς και απόβλητα διφασικού ελαιοτριβείου, σε μείγματα ή χωριστά. Σε παρούσα διατριβή την επίδραση (α) ενδογενών παραγόντων (εξέταση διαφορετικών στελεχών Pleurotus) και (β) εξωγενών παραγόντων (εξέταση καρποσωμάτων που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικά υποστρώματα καλλιέργειας) στα προφίλ των ελεύθερων αμινοξέων (FAAs) και των πτητικών ενώσεων που χαρακτηρίζουν το άρωμα των μανιταριών. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια διάκρισης που βασίζεται σε αυτές τις ενώσεις μεταξύ ειδών, στελεχών ή/και υποστρωμάτων. Το προφίλ των ελεύθερων αμινοξέων προσδιορίστηκε με αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μάζας χρησιμοποιώντας το αναλυτικό πρωτόκολλο του EZ:faast™ για GC-MS της Phenomenex. Οι πτητικές ενώσεις απομονώθηκαν από φρέσκα καρποσώματα με μικροεκχύλιση στερεής φάσης (SPME) και αναλύθηκαν με GC-MS. Το ίδιο αναλυτικό σχήμα εφαρμόστηκε σε επιλεγμένα δείγματα μανιταριών για να εκτιμηθεί η επίδραση του μαγειρέματος (ψήσιμο) στα προφίλ των πτητικών ενώσεων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν οι φασματοσκοπικές τεχνικές πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και υπέρυθρου (FT-IR) για τον εντοπισμό των ομάδων και των ενώσεων που διαμορφώνουν το ολικό μεταβολικό προφίλ των μανιταριών, ιδιαίτερα για το P. nebrodensis για το οποίο η βιβλιογραφία είναι περιορισμένη. Συνολικά, προσδιορίστηκαν 22 ελεύθερα αμινοξέα σε υποστρώματα και μανιτάρια, συμπεριλαμβανομένων όλων των απαραίτητων αμινοξέων, του νευροδιαβιβαστή γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) και της ορνιθίνης. Επί ξηρού βάρους (d.w.), τα συνολικά ελεύθερα αμινοξέα κυμάνθηκαν από 17,37 mg/g στο P. nebrodensis έως 130,12 mg/g στα δείγματα P. ostreatus, με κυρίαρχα την αλανίνη, τη λευκίνη, τη γλουταμίνη, την βαλίνη και τη σερίνη. Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των ελεύθερων αμινοξέων μεταξύ των ειδών που εξετάστηκαν και μεταξύ των υποστρωμάτων καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκαν. Η Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) που πραγματοποιήθηκε στο προφίλ των ελεύθερων αμινοξέων των στελεχών Pleurotus, διαχώρισε σαφώς το P. ostreatusαπό το P. eryngii και το P. nebrodensis, σύμφωνα και με τη φυλογενετική τους συγγένεια. Όσον αφορά στο προφίλ των πτητικών ενώσεων, προσδιορίστηκαν περισσότερες από 50 ενώσεις σε δείγματα φρέσκων μανιταριών, με το P. ostreatusνα παρουσιάζει υψηλότερες συγκεντρώσεις αλλά μικρότερο αριθμό πτητικών ενώσεων σε σύγκριση με το P. eryngii. Το ψήσιμο είχε ως αποτέλεσμα τη μερική εξάλειψη πτητικών ενώσεων και το σχηματισμό νέων ενώσεων, όπως πυραζινών, αλδεϋδών Strecker και ενώσεων θείου. Η ανάλυση κύριων συνιστωσών στα δεδομένα των πτητικών συστατικών πέτυχε την διάκριση μεταξύ φρέσκων και μαγειρεμένων μανιταριών καθώς και μεταξύ διαφορετικών ειδών και στελεχών Pleurotus, αλλά όχι ως προς τα διαφορετικά υποστρώματα καλλιέργειας. Οι κετόνες, οι αλκοόλες και το τολουόλιο ήταν κυρίως υπεύθυνες για τη διάκριση μεταξύ των στελεχών του P. ostreatus, ενώ οι αλδεΰδες και οι μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων συνέβαλαν περισσότερο στον διαχωρισμό των στελεχών του P. eryngii. Για το ολικό μεταβολικό προφίλ με φασματοσκοπία NMR, χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία παλμών 1D NOESY-PRESAT η οποία πέτυχε την ταυτοποίηση 91 μεταβολιτών, 23 από τους οποίους ανιχνεύθηκαν μόνο στο P. nebrodensis. Μεταβολίτες όπως ελεύθερα αμινοξέα, υδατάνθρακες, νουκλεοσίδια και οργανικά οξέα συσχετίστηκαν με την ομαδοποίηση των δειγμάτων. Η εφαρμογή της φασματοσκοπίας FT-IR κατέγραψε μεταβολές στα φάσματα ανάλογα με το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε. Για παράδειγμα, τα φάσματα μανιταριών που καλλιεργήθηκαν σε υποστρώματα που περιείχαν παραπροϊόντα ελαιοκομίας/ελαιουργίας είχαν ισχυρότερες εντάσεις απορρόφησης σε περιοχές που σχετίζονται με αρωματικές ενώσεις (π.χ. φαινολικές ενώσεις), ενώ αυτά που καλλιεργήθηκαν σε άχυρο ή στέμφυλα είχαν ισχυρότερες απορροφήσεις σε περιοχές που σχετίζονται με υδατάνθρακες. Η PCA στα φάσματα FT-IR διαφοροποίησε τα δείγματα ανάλογα με το είδος και ανέδειξε διαφορές σχετικά με τα υποστρώματα καλλιέργειας.Συμπερασματικά, στα τρία είδη Pleurotus, τα υποστρώματα καλλιέργειας δεν φαίνεται να επηρεάζουν δραματικά μεμονωμένες ομάδες ενώσεων όπως τα ελεύθερα αμινοξέα και τα πτητικά συστατικά. Αυτό υποδεικνύει ότι οι ενδογενείς (γενετικοί) παράγοντες μπορεί να έχουν ισχυρότερη επίδραση από τους εξωγενείς (περιβαλλοντικοί, υποστρώματα) για τις παρατηρούμενες ομαδοποιήσεις των δειγμάτων. Από την άλλη πλευρά, η μη στοχευμένη ανάλυση έδειξε ότι τα τρία είδη Pleurotus επηρεάστηκαν με διαφορετικό τρόπο από το υπόστρωμα καλλιέργειας, απορροφώντας επιλεκτικά οργανικές ενώσεις και παράγοντας μανιτάρια υψηλής προστιθέμενης αξίας. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιήθηκαν οι παραπάνω αναλύσεις στο απειλούμενο είδος P. nebrodensis.