Ο ρόλος των μη κωδικών RNA σε ασθενείς με πλασματοκυτταρικά νεοπλάσματα

Abstract

Background: Multiple myeloma (MM) is the second most common hematologic malignancy arising from the clonal proliferation of malignant plasma cells. Multiple myeloma bone disease (MMBD) constitutes a common and severe complication of MM. miRNAs are small non-coding RNAs that participate in the post-transcriptional regulation of gene expression. tRNA-derived RNA fragments (tRFs) constitute a class of small non-coding RNAs, deriving from tRNAs. Herein, we have studied the clinical utility of miRNAs and tRFs in improving patients’ risk stratification and prognosis, as well as their role as biomarkers able to predict the presence of MMBD.Materials and Methods: The study was conducted in three stages. For the first stage, CD138+ plasma cells were selected from bone marrow aspirates from MM (n=76) and smoldering MM (sMM) patients (n=18). Total RNA was extracted and in vitro polyadenylated. First-strand cDNA synthesis was performed, using an oligo-dT-adapter primer. For the relative quantification of the investigated miRNAs and tRFs, an in-house real-time quantitative PCR (qPCR) assay was developed. During the second stage, miRNA-seq was performed in CD138+ plasma cells of MM, sMM, and monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) patients. The MM cohort consisted of 138 patients. Quantification was performed by RT-qPCR. Regarding the third stage, miRNAs were isolated from the plasma of 62 MM patients with or without MMBD. First-strand cDNA was synthesized, and relative quantification was performed using qPCR. Lastly, we carried out extensive biostatistical analysis.Results: miR-16-5p (p=0.036), miR-155-5p (p=0.045) and 3’-tRF-LeuAAG/TAG (p = 0.041) expression was significantly lower in the CD138+ plasma cells of MM patients compared to sMM patients. Furthermore, lower levels of miR-15a-5p, miR-16-5p, miR-222-3p, and i-tRF-GlyGCC (p=0.037, p=0.035, p=0.037 and p = 0.047 respectively) were observed in the CD138+ plasma cells of MM patients with MMBD, compared to those without. miR-125b-5p levels were higher in the CD138+ plasma cells of MM patients presenting with skeletal-related events (SREs) (p = 0.005). Our results showed that elevated levels of itRF-ProTGG, i-tRF-GluCTC, i-tRF-HisGTG, i-tRF-PheGAA, 3’-tRF-LeuAAG/TAG, and miR-223-3p are indicators of prolonged overall survival (OS) compared to lower levels of these molecules (p = 0.024, 0.014, 0.003, 0.040, 0.039, and p=0.046 respectively). i-tRF-GlyGCC and 3’-tRF-LeuAAG/TAG overexpression is associated with significantly longer progression-free survival intervals (PFS) regarding first-line treatment (p = 0.016 and 0.013 respectively). miRNA-seq highlighted miR-181a to be upregulated in MM vs. sMM/MGUS, and R-ISS III vs. I patients. miR-181a overexpression was associated with significantly higher risk for short-term progression (p= 0.001) and worse survival (p < 0.001). Multivariate models integrating miR-181a with disease established markers led to superior risk stratification and clinical benefit for MM prognosis. Circulating levels of let-7b-5p (p = 0.034), miR-143-3p (p = 0.021), miR-17-5p (p = 0.025), miR-214-3p 3p (p = 0.004), and miR-335-5p (p = 0.022), were significantly higher in the plasma of MM patients with MMBD compared to those without. Receiver operating characteristic curve and logistic regression analyses showed that these miRNAs could accurately predict MMBD, either standalone or in a multi-miRNA–based logistic regression model.Conclusions: In conclusion, we propose a miRNA and tRF signature with putative clinical utility in MM. We also propose miR-181a as a biomarker strongly correlated with inferior disease outcome and survival, which is independent of the established prognostic biomarkers and can enhance their prognostic ability. Lastly, our study proposes a circulating miRNA signature to facilitate MMBD diagnosis.

Εισαγωγή: Το πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ) είναι η δεύτερη συχνότερη αιματολογική κακοήθεια που προέρχεται από τον κλωνικό πολλαπλασιασμό κακοήθων πλασματοκυττάρων. Η οστική νόσος του ΠΜ αποτελεί μια συχνή και σοβαρή επιπλοκή. Τα miRNAs είναι μικρά μη κωδικά RNAs που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Τα tRFs (tRNA-derived RNA fragments) αποτελούν μια ομάδα μικρών μη κωδικών RNAs που προέρχονται από τα tRNAs. Στην παρούσα διατριβή μελετάται η κλινική αξία των μορίων αυτών στο ΠΜ, καθώς και ο ρόλος τους ως βιοδείκτες που δύνανται να προβλέψουν την παρουσία οστικής νόσου.Υλικά και Μέθοδοι: Η παρούσα μελέτη διεξήχθη σε τρία στάδια. Για το πρώτο στάδιο, CD138+ πλασματοκύτταρα απομονώθηκαν από το μυελό των οστών ασθενών με ΠΜ (n=76) και ασυμπτωματικό ΠΜ (n=18). Το ολικό RNA απομονώθηκε και πολυαδενυλιώθηκε in vitro. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cDNA) με τη χρήση ενός oligo-dT εκκινητή. Για τη σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των μελετούμενων tRFs και miRNAs χρησιμοποιήθηκε PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR). Κατά το δεύτερο στάδιο, miRNA-seq πραγματοποιήθηκε στα CD138+ πλασματοκύτταρα ασθενών με ΠΜ, ασυμπτωματικό ΠΜ και μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (ΜΓΑΣ). 138 ασθενείς συπεριλήφθησαν στην κοόρτη του ΠΜ και η ποσοτικοποίηση έγινε με RT-qPCR. Στο τρίτο στάδιο, miRNAs απομονώθηκαν από το πλάσμα 62 ασθενών με ΠΜ με ή χωρίς οστική νόσο. Πραγματοποιήθηκε σύνθεση cDNA και ποσοτικοποίηση της έκφρασης με RT-qPCR. Τέλος, πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων.Αποτελέσματα: Η έκφραση των miR-16-5p (p=0.036), miR-155-5p (p=0.045) και 3’-tRF-LeuAAG/TAG (p = 0.041) ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα CD138+ πλασματοκύτταρα ασθενών με ΠΜ σε σύγκριση με αυτών με ασυμπτωματικό ΠΜ. Ακόμη, χαμηλότερη έκφραση των miR-15a-5p, miR-16-5p, miR-222-3p, και i-tRF-GlyGCC (p=0.037, p=0.035, p=0.037 και p = 0.047 αντίστοιχα) παρατηρήθηκε στα CD138+ πλασματοκύτταρα ασθενών με ΠΜ και οστική νόσο συγκριτικά με αυτά ασθενών χωρίς. Τα επίπεδα του miR-125b-5p ήταν υψηλότερα στα πλασματοκύτταρα ασθενών με σκελετικά συμβάματα (SREs) (p = 0.005). Υψηλά επίπεδα των itRF-ProTGG, i-tRF-GluCTC, i-tRF-HisGTG, i-tRF-PheGAA, 3’-tRF-LeuAAG/TAG, και miR-223-3p είναι ενδεικτικά μεγαλύτερων διαστημάτων ολικής επιβίωσης (OS) συγκριτικά με τα χαμηλότερα επίπεδα αυτών (p = 0.024, 0.014, 0.003, 0.040, 0.039, και p=0.046 αντίστοιχα). Η υπερέκφραση των i-tRF-GlyGCC και 3’-tRF-LeuAAG/TAG σχετίζεται με μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερης προόδου νόσου επιβίωσης (PFS) μετά την πρώτη γραμμή θεραπείας (p = 0.016 και 0.013 αντίστοιχα). Μέσω miRNA-seq βρέθηκε ότι το miR-181a υπερεκφράζεται στο ΠΜ σε σχέση με το ασυμπτωματικό ΠΜ και το ΜΓΑΣ, καθώς και στο R-ISS III σε σχέση με το R-ISS I. Η υπερέκφραση του miR-181a συσχετίζεται με σημαντικά μεγαλύτερο κίνδυνο πρώιμης υποτροπής (p= 0.001) και χειρότερη επιβίωση (p < 0.001). Πολυπαραγοντικά μοντέλα που ενσωμάτωσαν το miR-181a με καθιερωμένους προγνωστικούς παράγοντες οδήγησαν σε ακριβέστερη σταδιοποίηση κινδύνου και καλύτερη εκτίμηση της πρόγνωσης. Τα επίπεδα στο πλάσμα των let-7b-5p (p = 0.034), miR-143-3p (p = 0.021), miR-17-5p (p = 0.025), miR-214-3p 3p (p = 0.004), και miR-335-5p (p = 0.022), ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με οστική νόσο. Η ανάλυση ROC και λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι τα μόρια αυτά μπορούν να προβλέψουν την παρουσία οστικής νόσου ανεξάρτητα ή ως μεταβλητές ενός πολυπαραγοντικού μοντέλου.Συμπεράσματα: Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη προτείνει μια «υπογραφή» miRNA και tRF με πιθανή κλινική αξία στο ΠΜ. Επίσης, προτείνεται το miR-181a ως βιοδείκτης που σχετίζεται με δυσμενή έκβαση της νόσου και χειρότερη επιβίωση, ο οποίος είναι ανεξάρτητος των εδραιωμένων παραγόντων κινδύνου και μπορεί να ενισχύσει την προγνωστική τους ικανότητα. Τέλος, η μελέτη μας προτείνει μια υπογραφή κυκλοφορούντων miRNAs που συμβάλλει στη διάγνωση της οστικής νόσου.