Τεχνολογικές εφαρμογές βιοδραστικών μορίων φυσικών προϊόντων: σταθερότητα και συστήματα μεταφοράς και αποδέσμευσης

Abstract

The chiral pair alkannin and shikonin and their ester derivatives (A/S), are lipophilic secondary metabolites possessing a wide spectrum of pharmacological properties such as strong wound healing, anti-microbial, anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activity. Their incorporation in lipid-based drug delivery systems can enhance their therapeutic efficacy, especially for dermal or transdermal applications. The present doctoral thesis aimed to (a) design, develop and characterize lipid based nanocarriers for encapsulating alkannins and shikonins for dermal applications and (b) examine the stability of pharmaceutical substance shikonin under various conditions. In this work, A/S in the form of oily extracts were entrapped in liposomes prepared with the commercial product Pro-LipoTM Neo and isolated mixture of pigments from Alkanna tinctoria roots were encapsulated in lipid based nanocarriers prepared with Phosal® 40 IP. In both cases, Experimental Design was carried out to evaluate the effect of process parameters on mean particle size, ζ-potential and entrapment efficiency, aiming to identify the optimum process conditions. The optimum oily extract loaded liposomes showed a mean particle size of 106 nm, ζ-potential value of -45.1 mV and entrapment efficiency (EE%) up to 72% and they were stable for six weeks. On the other hand, the optimum nanocarriers for the incorporation of A/S mixture showed a mean particle size of 138 nm, ζ-potential value of -15.6 mV and EE% up to 56%. The in vitro release profiles for both drug delivery systems were satisfactory and revealed that, in both cases, the release of the active pharmaceutical ingredients from the nanocarriers is controlled by diffusion. Moreover, we evaluated the effect of the optimum formulations on the viability of human dermal fibroblasts and we found that, A/S mixture loaded nanocarriers enhance cell viability. In order to assess the effect of A/S derivatives loaded nanocarriers on human fibroblasts we targeted genes related to the antioxidant cellular response, cell aging and extracellular matrix organization. The findings showed that nanocarriers induced the antioxidant response, presented a positive impact on cells’ longevity and promoted extracellular matrix organization. Based on these findings, formulated nanocarriers can be used as a potential drug delivery system for dermal applications in cosmetic products. The stability of the pharmaceutical substance shikonin was examined in various solvents (methanol, acetone, chloroform and n-hexane) under sunlight exposure, storage at ambient temperature and heating. According to the chiral-HPLC/UV-Vis analysis, the enantiomeric ratio of shikonin/alkannin remained stable despite the formation of several by-products. On the other hand, the results of Liquid Chromatography- Mass Spectrometry analysis, showed that the concentration of shikonin in all solutions which were exposed to sunlight decreased within 2 weeks. While the degradation rate was not the same for the four solvents, the main by-product was the same, since theirs MS spectrums were same. Samples of shikonin in methanol which have been heated over to 60 oC led to the formation of dimers, whereas shikonin in n-hexane was stable under heating up to 70 oC.

Οι ενώσεις αλκαννίνη, σικονίνη και τα παράγωγά τους, είναι λιπόφιλοι δευτερογενείς μεταβολίτες με αποδεδειγμένες φαρμακολογικές ιδιότητες, όπως επουλωτική, αντιφλεγμονώδης, αντιμικροβιακή και αντικαρκινική. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από δύο μέρη, στο πρώτο μέρος σχεδιάστηκαν, αναπτύχθηκαν και χαρακτηρίστηκαν δύο λιπιδικά συστήματα μεταφοράς και αποδέσμευσης αλκαννινών και σικονινών για τοπική εφαρμογή ενώ στο δεύτερο μέρος εξετάσθηκε η σταθερότητα της φαρμακευτικής ουσίας σικονίνης. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν λιποσώματα, χρησιμοποιώντας το προϊόν Pro-LipoTM Neo, για τον εγκλεισμό ελαιώδους εκχυλίσματος ριζών Alkanna tinctoria. Χρησιμοποιήθηκε εδρο-κεντρωμένος πειραματικός σχεδιασμός για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις: (α) του λόγου δραστική ουσία/ λιπιδική φάση, (β) του λόγου υδατική/ λιπιδική φάση και (γ) της περιεκτικότητας του εκχυλίσματος σε αλκαννίνες και σικονίνες στα χαρακτηριστικά του φορέα (μέσο μέγεθος σωματιδίων, ζ-δυναμικό και % απόδοση εγκλεισμού), με σκοπό να βελτιστοποιηθούν οι παράμετροι παρασκευής του συστήματος. Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, τα χαρακτηριστικά των βέλτιστων λιποσωμάτων ήταν μέσο μέγεθος σωματιδίων 106 nm, τιμή ζ-δυναμικού -45,1 mV και % απόδοση εγκλεισμού των αλκαννινών/σικονινών 72%. Το βέλτιστο σύστημα φορέα-φαρμάκου ήταν σταθερό για έξι εβδομάδες και βρέθηκε ότι επάγει τη βιωσιμότητα πρωτογενών φυσιολογικών δερματικών ινοβλαστών. Το δεύτερο λιπιδικό σύστημα παρασκευάστηκε με τη χρήση του προϊόντος Phosal® 40 IP. Στο σύστημα αυτό εγκλείστηκαν αλκαννίνες και σικονίνες απομονωμένες από τις ρίζες του φυτού Alkanna tinctoria. Και στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιήθηκε εδρο-κεντρωμένος πειραματικός σχεδιασμός για να εξετασθούν οι επιδράσεις: (α) της αναλογίας δραστική ουσία/ λιπιδική φάση, (β) της αναλογίας χοληστερόλη/ λιπιδική φάση και (γ) του χρόνου γαλακτωματοποίησης στα χαρακτηριστικά του φορέα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, τα χαρακτηριστικά των βέλτιστων φορέων ήταν μέσο μέγεθος σωματιδίων 138 nm, τιμή ζ-δυναμικού -15,6 mV και αποτελεσματικότητα εγκλεισμού των αλκαννινών/σικονινών 56%. Η αποδέσμευση των δραστικών συστατικών από τον φορέα ελέγχεται από τον μηχανισμό της διάχυσης και οι βέλτιστοι λιπιδικοί νανοφορείς εμφάνισαν φυσική σταθερότητα για διάστημα δύο μηνών. Τέλος αξιολογήθηκε η πιθανή κυτταροτοξική δράση των λιπιδικών νανοφορέων σε δερματικούς ινοβλάστες και βρέθηκε ότι επάγουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων έως και 95% σε συγκεντρώσεις δραστικής ουσίας στο φορέα μικρότερες από 10 μm/mL. Με βάση την έλλειψη κυτταροτοξικής δράσης οι λιπιδικοί νανοφορείς αξιολογήθηκαν περαιτέρω και βρέθηκε ότι η επίδραση του συστήματος στους δερματικούς ινοβλάστες προκαλεί θετικές μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων προάγοντας την κυτταρική αντιοξειδωτική απόκριση, την μακροζωία των κυττάρων και ευνοώντας την οργάνωση της εξωκυττάριας μήτρας. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής εξετάσθηκαν τα παραπροϊόντα που προκύπτουν από την αποθήκευση της σικονίνης σε διαλύματα μεθανόλης, αιθανόλης, χλωροφορμίου και εξανίου παρουσία και απουσία ηλιακής ακτινοβολίας, από την έκθεση διαλυμάτων σικονίνης σε μεθανόλη και εξάνιο παρουσία τεχνητής ακτινοβολίας αλλά και από τη θέρμανση διαλυμάτων μεθανόλης. Αρχικά αξιολογήθηκε η πιθανή επίδραση στο λόγο εναντιομέρειας αλκαννίνης/σικονίνης στα εξεταζόμενα δείγματα και βρέθηκε ότι ο λόγος παραμένει σταθερός παρά την εμφάνιση νέων προϊόντων. Επιπλέον, η ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματόμετρο μαζών έδειξε ότι το ηλιακό φως αλλά και η έκθεση στην τεχνητή ακτινοβολία οδηγούν στη διάσπαση της σικονίνης και στην εμφάνιση πολλαπλών παραπροϊόντων. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η θέρμανση μεθανολικών διαλυμάτων σικονίνης σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 60 oC οδηγεί στη δημιουργία διμερών σικονίνης με m/z 558 και 574.