Evaluation of microneurotrophins activity on neurotrophins receptors and their role in signalling, in in vitro an in vivo neurodegenerative conditions, such as alzheimer's disease

Abstract

Alzheimer’s Disease is a devastating neurodegenerative disorder, which currently affects more than 50 million people worldwide. Clinically, the disease is characterized by cognitive impairment, including severe memory loss, that results in patients having difficulties in performing simple everyday tasks. Pathologically, the hallmarks of the disease include the deposition of amyloid-β plaques extracellularly and the presence of hyperphosphorylated neurofibrillary tau tangles intracellularly. Neurotrophins are a family of secreted proteins, with Nerve Growth Factor (NGF) and Brain-Derived Neurotrophin Factor (BDNF) as the most prominent family members. These control neuronal development and survival and have also been shown to modulate neuronal and synaptic function in adult brain, acting through specific high-affinity receptors, namely TrkA for NGF and TrkB for BDNF. Moreover, all neurotrophins activate the p75 pan-neurotrophin receptor although with variable affinity. Many studies have shown that neurotrophins’ processing and expression levels are deregulated in AD, and this has been postulated to significantly contribute to the disease pathophysiology. Our lab has previously identified BNN27 and BNN20, two small molecules DHEA derivatives that act through TrkA, TrkB and p75 receptor in a way that resembles some of the NGF or BDNF actions, such as protecting specific neuronal populations against apoptosis. Such molecules present great potential as therapeutic agents against neurodegenerative diseases, as they can selectively mimic only specific, beneficial neurotrophic actions while avoiding undesired side effects. For the present PhD thesis, we screened and identified a series of neurotrophin analogues, which can selectively bind and activate neurotrophin receptors. Specifically, we used cell lines to identify novel small molecule DHEA derivatives that can selectively activate TrkA and can protect against cell death. These molecules, along with few more selective for TrkB were then screened using primary neuronal cells challenged with the toxic Aβ oligomers for their ability to protect cells against Aβ-mediated cell death and synapse degeneration. Lastly, we selected one potent TrkB agonist and tested it in vivo in the 5xFAD animal model of AD. 4-month-old animals were treated for 2 months with the drug and the efficacy of the drug to reverse the behavioural deficits was evaluated. More specifically, we showed that ENT-A061-treated 5xFAD animals showed improved ability to discriminate between environments based on context compared to placebo-treated 5xFAD littermates in the contextual fear discrimination paradigm, and similar to WT animals, a process that has been correlated with increased neurogenesis. In conclusion, ENT-A061 showed promise in improving certain aspects of AD pathology by enhancing adult hippocampal neurogenesis.

Η νόσος Αλτσχάιμερ είναι μια καταστροφική νευροεκφυλιστική διαταραχή, η οποία πλήττει σήμερα περισσότερα από 50 εκατομμύρια άτομα παγκοσμίως. Κλινικά, η νόσος χαρακτηρίζεται από σοβαρή απώλεια μνήμης και γνωστική εξασθένιση που έχει ως αποτέλεσμα οι ασθενείς να αντιμετωπίζουν δυσκολίες στην εκτέλεση απλών καθημερινών εργασιών. Παθολογικά, τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της νόσου περιλαμβάνουν την εναπόθεση πλακών αμυλοειδούς-β εξωκυτταρικά και την παρουσία υπερφωσφορυλιωμένων νευροϊνιδιακών δεσμών tau ενδοκυτταρικά. Οι νευροτροφίνες είναι μια οικογένεια εκκρινόμενων πρωτεϊνών, με τον Nerve Growth Factor (NGF) και τον Brain Derived Neurotrophin Factor (BDNF) ως τα πιο γνωστά μέλη της οικογένειας. Αυτές ελέγχουν την ανάπτυξη και την επιβίωση των νευρώνων και έχει επίσης δειχθεί ότι διαμορφώνουν τη νευρωνική και συναπτική λειτουργία στον ενήλικο εγκέφαλο, δρώντας μέσω ειδικών υποδοχέων υψηλής συγγένειας, του TrkA για τον NGF και του TrkB για τον BDNF. Επιπλέον, όλες οι νευροτροφίνες ενεργοποιούν τον παν-νευροτροφινικό υποδοχέα p75, αν και με χαμηλότερη συγγένεια. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα επεξεργασίας και έκφρασης των νευροτροφινών απορρυθμίζονται στη ΝΑ και αυτό έχει θεωρηθεί ότι συμβάλλει σημαντικά στην παθολογία της νόσου. Το εργαστήριό μας έχει προηγουμένως εντοπίσει τα BNN27 και BNN20, δύο μικρά μόρια παραγώγων της DHEA που δρουν μέσω των υποδοχέων TrkA, TrkB και p75 και μοιάζουν με ορισμένες από τις δράσεις του NGF ή του BDNF, όπως η προστασία συγκεκριμένων νευρωνικών πληθυσμών από την απόπτωση. Τέτοια μόρια παρουσιάζουν μεγάλες δυνατότητες ως θεραπευτικοί παράγοντες κατά των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, καθώς μπορούν να μιμηθούν επιλεκτικά μόνο συγκεκριμένες, ευεργετικές νευροτροφικές δράσεις, αποφεύγοντας τις ανεπιθύμητες παρενέργειες. Για την παρούσα διδακτορική διατριβή, ελέγξαμε και ταυτοποιήσαμε μια σειρά αναλόγων νευροτροφίνης, τα οποία μπορούν να δεσμεύουν και να ενεργοποιούν επιλεκτικά υποδοχείς νευροτροφίνης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές για τον εντοπισμό νέων μικρών μορίων DHEA παραγώγων που μπορούν να ενεργοποιήσουν επιλεκτικά τον TrkA και μπορούν να προστατεύσουν από τον κυτταρικό θάνατο. Τα μόρια τα οποία εντοπίστηκαν από το πρώτο αυτό έλεγχο, μαζί με άλλα ακόμη εκλεκτικά για τον TrkB, υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε έλεγχο, χρησιμοποιώντας πρωτογενή νευρωνικά κύτταρα που προσβλήθηκαν με τα τοξικά ολιγομερή Aβ, για την ικανότητά τους να προστατεύουν τα κύτταρα από τον κυτταρικό θάνατο και τον εκφυλισμό των συνάψεων με τη μεσολάβηση του Aβ. Τέλος, επιλέξαμε έναν ισχυρό αγωνιστή TrkB και τον δοκιμάσαμε in vivo στο ζωικό μοντέλο 5xFAD της AD. Τα ζώα ηλικίας 4 μηνών έλαβαν θεραπεία για 2 μήνες με το φάρμακο και αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου για την αναστροφή των συμπεριφορικών ελλειμμάτων. Πιο συγκεκριμένα, δείξαμε ότι τα ζώα 5xFAD που έλαβαν θεραπεία με ENT-A061 παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα διάκρισης μεταξύ περιβαλλόντων με βάση το πλαίσιο σε σύγκριση με τα συνομήλικά τους ζώα 5xFAD που έλαβαν εικονικό φάρμακο στο παράδειγμα διάκρισης φόβου με βάση το πλαίσιο, και παρόμοια με τα ζώα WT, μια διαδικασία που έχει συσχετιστεί με αυξημένη νευρογένεση. Το ENT-A061 έδειξε ότι υπόσχεται να βελτιώσει ορισμένες πτυχές της παθολογίας της ΝΑ ενισχύοντας την ενήλικη νευρογένεση του ιππόκαμπου. Συμπερασματικά, τα ευρήματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη διατριβή αποκαλύπτουν την ανακάλυψη πολλών νέων ενώσεων που στοχεύουν και ενεργοποιούν ειδικά τη σηματοδότηση των νευροτροφινών, με έμφαση στους υποδοχείς TrkA και TrkB. Μέσω μιας ολοκληρωμένης αξιολόγησης αυτών των ενώσεων, προσδιορίστηκαν τα προφίλ ενεργοποίησης ενός εκτεταμένου καταλόγου ενώσεων και παρασχέθηκαν στοιχεία που υποστηρίζουν την ενεργοποίηση και την αποτελεσματικότητα ενός επιλεγμένου υποσυνόλου αυτών των ενώσεων. Τα αποτελέσματα αυτά χρησιμεύουν ως στέρεη βάση για τη συνεχή ανάπτυξη και βελτίωση αυτών των ενώσεων ως δυνητικών θεραπευτικών παραγόντων για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Αποδεικνύοντας την ικανότητά τους να ενεργοποιούν τη σηματοδότηση των νευροτροφινών, οι ενώσεις αυτές έχουν τη δυνατότητα να έχουν σημαντικό αντίκτυπο στη θεραπεία και τη διαχείριση αυτών των εξουθενωτικών καταστάσεων. Με περαιτέρω έρευνα και βελτιστοποίηση, αυτές οι νέες ενώσεις μπορεί να προσφέρουν ελπίδα για τα εκατομμύρια των ανθρώπων που πάσχουν από νευροεκφυλιστικές νόσους.