Μελέτη των παρακρινών αλληλεπιδράσεων μεταξύ στρωματικών και καρκινικών κυττάρων μαστού: ο ρόλος της κυτταρικής γήρανσης

Abstract

Tumor stroma is an important factor influencing tumor appearance and progression. Fibroblasts, located at tumor microenvironment are responsible for the production of extracellular matrix molecules. Since fibroblasts contribute to ECM formation, they play a vital role in paracrine interaction between tumor and stroma. In cancer therapy, a widely used method is ionizing radiation that aims and kills cancer cells. However, besides cancer cells the use of ionizing radiation affects adjacent stromal cells, leading to a condition known as premature cellular senescence. Regarding breast cancer, an alternative antitumor treatment focuses on the regulation of estrogen activity, since 60% of patients with breast cancer are ERα receptor positive. Estrogens, and mostly estradiol (E2) are important for normal development, homeostasis and pathophysiology of breast tissue. Nevertheless, the majority of research studies investigate how estrogens affect tumor cells but not stromal cells.Given the above facts, we studied the effect of E2 on stromal fibroblasts. The results suggest that estradiol does not affect survival, proliferation and expressions of molecules related to ECM homeostasis. ERβ and GPER expression from breast stromal fibroblasts is low and is unaffected after incubation with E2.We also noticed that breast stromal fibroblasts are led to premature senescence both in vitro and in vivo, after treatment with ionizing radiation. Premature senescent stromal fibroblasts have a catabolic phenotype, which is likely that to promote tumor progression.Formation of stroma is crucial for tumor progression and therefore we sought to investigate the expression of molecules related to ECM homeostasis from premature senescent stromal fibroblasts due to ionizing radiation versus young fibroblasts. Particularly, the expression of col1a was decreased, MMP1 and MMP3 expression was increased, while expression of TIMPs inhibitors was not affected. Additionally, MMPs activity was substantially increased in conditioned media from premature senescent fibroblasts compared to young fibroblasts.Moreover, we studied the expression of proteoglycan syndecan-1, whose overexpression is considered as a poor prognostic marker for disease progression. Syndecan-1 was significantly increased at senescent cells compared to young ones, not only in mRNA and protein level in vitro, but also in vivo, according to immunohistochemistry assay.In order to study the interaction between stromal and cancer cells, we focused on the effect of conditioned media from aggressive epithelial breast cancer cells, MDA-MB-231, on human breast stromal fibroblasts. Increased MMP1 expression was observed, while there was a decrease on TIMP2 and col1a. Most importantly, syndecan-1 expression was also increased and found on even higher levels when tested in senescent fibroblasts.Taking into consideration the importance of syndecan-1 as prognostic marker for breast cancer, we studied the mechanism that induced its higher expression and concluded that syndecan-1 overexpression occurs via TGF-β1. Furthermore, upon incubation with an inhibitor of TGF-β receptor activation, overexpression of syndecan-1 due to MDA-MB-231 conditioned media was fully suppressed. Finally, we identified that Smad pathway acts together with transcription factor Sp1 activated by TGF-β, leading to syndecan-1 overexpression.The in-depth understanding of the above observations may contribute to the development of novel therapeutic interventions against breast cancer.

Μια πληθώρα νέων δεδομένων υποδεικνύουν πως το στρώμα αποτελεί μια σημαντική παράμετρο για την ανάπτυξη του όγκου. Ανάμεσα στα κύτταρα του στρώματος οι ινοβλάστες είναι ο πιο συνηθισμένος κυτταρικός τύπος που συναντάται στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή και τον καταβολισμό των μορίων της εξωκυττάριας μήτρας (Extracellular Matrix, ECM) καθώς και για την έκκριση αρκετών ρυθμιστικών μορίων, και κατά συνέπεια παίζουν καθοριστικό ρόλο στις παρακρινείς αλληλεπιδράσεις όγκου και στρώματος.Τόσο η ομοιοστασία του μαζικού αδένα, όσο και η ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού, επηρεάζονται σημαντικά από τα οιστρογόνα και ιδίως από την οιστραδιόλη (E2). Ενώ οι περισσότερες μελέτες εστιάζουν στη δράση των οιστρογόνων στον ίδιο τον όγκο, λίγη προσοχή έχει δοθεί στους στρωματικούς ινοβλάστες του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά εξετάσαμε την έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων α (ERα), ERβ και GPER σε ανθρώπινους στρωματικούς ινοβλάστες μαστού και βρήκαμε ότι η έκφρασή τους είναι σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού και δεν επηρεάζεται μετά από επώαση με Ε2. Επίσης, παρατηρήσαμε ότι η Ε2 δεν επηρεάζει τη φυσιολογία των στρωματικών ινοβλαστών όσον αφορά την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την έκφραση μορίων που σχετίζονται με την ομοιοστασία της εξωκυττάριας μήτρας.Στη θεραπεία κατά του καρκίνου του μαστού, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η χρήση της ιονίζουσας ακτινοβολίας, η οποία προκαλεί βλάβη στο DNA των καρκινικών κυττάρων, οδηγώντας σε αναστολή του πολλαπλασιασμού τους καθώς και σε απόπτωση. Όμως, πέρα από τα καρκινικά κύτταρα η ιονίζουσα ακτινοβολία επηρεάζει και τα παρακείμενα στρωματικά κύτταρα. Είδαμε ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία οδηγεί τους ανθρώπινους στρωματικούς ινοβλάστες μαστού σε πρόωρη κυτταρική γήρανση in vitro. Παράλληλα, παρατηρήσαμε την παρουσία μεγάλου αριθμού γηρασμένων κυττάρων σε ιστούς που είχαν εκτεθεί σε ιονίζουσα ακτινοβολία, υποδεικνύοντας πως το φαινόμενο αυτό συναντάται και in vivo. Η διαμόρφωση του στρώματος είναι σημαντική για την ανάπτυξη του όγκου και για το λόγο αυτό στα κύτταρα που έχουν οδηγηθεί σε πρόωρη γήρανση μέσω ιονίζουσας ακτινοβολίας μελετήσαμε κατά πόσο επηρεάζεται η έκφραση μορίων που σχετίζονται με την ομοιοστασία της εξωκυττάριας μήτρας σε σύγκριση με νεαρούς ινοβλάστες. Συγκεκριμένα, η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι (Col 1a) μειώθηκε, η έκφραση των μεταλλοπρωτεασών 1 και 3 (MMP1 και MMP3) αυξήθηκε, ενώ η έκφραση των αναστολέων των μεταλλοπρωτεασών (TIMPs) δεν μεταβλήθηκε. Άμεσο αποτέλεσμα ήταν η αύξηση της ενεργότητας των MMPs στο εθισμένο μέσο που συλλέξαμε από γηρασμένους ανθρώπινους στρωματικούς ινοβλάστες μαστού, συγκριτικά με νεαρούς ινοβλάστες. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι οι γηρασμένοι ανθρώπινοι στρωματικοί ινοβλάστες μαστού, παρόμοια με άλλους στρωματικούς ινοβλάστες, εκφράζουν έναν έντονα καταβολικό φαινότυπο.Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεογλυκάνες συμβάλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού. Ειδικά η συνδεκάνη 1, αποτελεί κακό προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη της νόσου, όταν υπερεκφράζεται στο στρώμα του όγκου. Διαπιστώσαμε σημαντική αύξηση της συνδεκάνης 1 στα γηρασμένα κύτταρα σε σχέση με τα νεαρά σε επίπεδο RNA και πρωτεΐνης in vitro, αλλά και in vivo με πειράματα ανοσοϊστοχημείας.Επιπλέον, είδαμε ότι το εθισμένο μέσο από επιθετικά καρκινικά κύτταρα μαστού MDA-MB-231 περιέχει εκκριτικούς παράγοντες, που επηρεάζουν την έκφραση των μορίων της εξωκυττάριας μήτρας που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Παρατηρήσαμε αύξηση στην έκφραση της MMP1, ενώ μειώθηκε η έκφραση του Col 1a και του TIMP2, ενισχύοντας έτσι τον καταβολικό φαινότυπο. Επιπροσθέτως, διαπιστώθηκε αύξηση της συνδεκάνης 1 σε νεαρούς και γηρασμένους στρωματικούς ινοβλάστες. Μελετήσαμε τον μηχανισμό που υποκινεί την αύξηση της συνδεκάνης 1 και βρήκαμε ότι οφείλεται στον παράγοντα TGF-β που εκκρίνεται από τα MDA-MB-231, και δρα μέσω του μονοπατιού των SMAD πρωτεϊνών σε συνεργασία με τον μεταγραφικό παράγοντα Sp1. Τέλος, δείξαμε ότι τα γηρασμένα στρωματικά κύτταρα δημιουργούν έναν αυτοκρινή βρόχο μέσω του TGF-β, ενεργοποιώντας το μονοπάτι των SMAD και σε συνεργασία με τον Sp1 οδηγούν σε αύξηση της συνδεκάνης 1.Τα παραπάνω δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, έχει ως παρενέργεια το σχηματισμό γηρασμένων στρωματικών ινοβλαστών. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν έναν καταβολικό φαινότυπο και αυξάνουν την έκφραση της συνδεκάνης 1, αλλαγές που αποτελούν σημαντικούς προγνωστικούς δείκτες για την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού. Τέλος, επιθετικά καρκινικά κύτταρα, μέσω ενός παρακρινούς μηχανισμού, επιτείνουν αυτές τις αλλαγές προς όφελος της αύξησης του όγκου. Η εις βάθος κατανόηση των παραπάνω φαινομένων, θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού.