Συγκριτική μελέτη μοριακών τεχνικών και ανοσοφθορισμού στην ανίχνευση κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού

Abstract

Background: Several techniques have been developed for the detection of circulating tumor cells (CTCs) in patients with breast cancer. We designed this study to compare the CellSearch system, with real time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and an immunofluorescent method for CTC detection in patients with breast cancer. Methods: Blood was obtained from patients with early and metastatic breast cancer before the initiation of adjuvant or first-line chemotherapy. Different aliquots of the same blood sample were evaluated for the presence of CTCs by the CellSearch System, the RT-qPCR and by double immunofluorescence (IF) microscopy.Results: In early breast cancer, using the CellSearch System, 37% and 16.5% of patients were CTC-positive (cut-offs ≥1 and ≥2 CTCs per 23 ml of blood), 18.0% by RT-qPCR and 16.9% by IF. In the metastatic setting, 34.8% of patients had ≥ 5 and 53.7% had ≥ 2 CTCs per 7.5 ml of blood, 37.8% were CTC-positive by RT-qPCR, and 28.5% by IF. In 60.8% of cases presenting discordant results by CellSearch and RT-qPCR, the differential expression of EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) and CK19 on CTCs, could explain the discrepancies observed. Conclusion: A significant concordance in CTC detection between the CellSearch and RT-qPCR was observed in metastatic setting. CTC detection by either method had prognostic relevance in metastatic patients. Discordant results could be explained in part by CTC heterogeneity.

Εισαγωγή: Πολλές τεχνολογίες απομόνωσης και ανίχνευσης των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs ή ΚΚΚ) έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια με ραγδαίο ρυθμό. Παρ΄ όλα αυτά η ασυμφωνία μεταξύ των διαφορετικών μεθόδων είναι μεγάλη, γεγονός που δυσχεραίνει την εφαρμογή τους στην καθημερινή κλινική πράξη. Σε αυτή την μελέτη, σκοπός είναι να συγκρίνουμε τρεις μεθοδολογίες ανίχνευσης των κυττάρων στο αίμα ασθενών με μεταστατικό και πρώιμο καρκίνο μαστού: την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου [Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)] για την ανίχνευση του mRNA της κυτταροκερατίνης 19 [Cytokeratin 19 (CK19)], τον ανοσοφθορισμό σε επιστρωμένες αντικειμενοφόρες πλάκες και το εγκεκριμένο από τον Αμερικάνικο Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) σύστημα Cell Search (Menarini, Silicon Biosystems, Italy), καθώς και να εκτιμήσουμε την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης σε σχέση με την κλινική έκβαση των ασθενών. Μέθοδοι: 200 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού και 164 με μεταστατικό καρκίνο μαστού ελέγχθησαν πριν την έναρξη συμπληρωματικής ή πρώτης γραμμής θεραπείας χρησιμοποιώντας το σύστημα Cell Search , την RT-qPCR για την ανίχνευση του CK-19 mRNA και την τεχνική του ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση των CTCs.Αποτελέσματα: Με το Cell Search System, το ποσοστό των ασθενών με πρώιμη νόσο που είχαν CTCs (cut off ≥1 και ≥2 CTCs σε 23 ml αίματος) ήταν 37% και 16.5% αντίστοιχα, με RT-qPCR 18.0% και με ανοσοφθορισμό 16.9%. Μεταξύ των μεθόδων δεν υπήρξε συμφωνία. Όσον αφορά στους μεταστατικούς ασθενείς, με το Cell Search System, ανιχνεύτηκαν CTCs στο 34.8% και 53.7% των ασθενών αντίστοιχα (για ≥ 5 και ≥ 2 CTCs σε 7.5 ml αίματος), με RT-qPCR 37.8% και με ανοσοφθορισμό 28.5%. Μία στατιστικά σημαντική συμφωνία παρατηρήθηκε μεταξύ του Cell Search System και της RT-qPCR. Σε ποσοστό 60.8% των περιπτώσεων, διαφορετική έκφραση του EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) και της CK-19 στα CTCs με ανοσοφθορισμό θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει τις διαφωνίες μεταξύ CellSearch System και RT-qPCR. Στην ομάδα των ασθενών με μεταστατική νόσο η ανίχνευση των CTCs με οποιαδήποτε από τις τρείς μεθόδους σχετίζονταν με μειωμένη συνολική επιβίωση. Συμπέρασμα: Μία στατιστικά σημαντική συμφωνία παρατηρήθηκε όσον αφορά την ανίχνευση των CTCs με την τεχνολογία Cell Search System και RT-qPCR στους μεταστατικούς ασθενείς και όχι στους ασθενείς με πρώιμη νόσο μαστού. Εξαιτίας της ετερογένειας των καρκινικών κυττάρων, κάποιες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων θα μπορούσαν να δικαιολογηθούν. Η ανίχνευση των CTCs με όλες τις μεθόδους αποδείχθηκε ότι είχε προγνωστική σημασία στις ασθενείς με μεταστατική νόσο.