The role of inflammation and early exposure to Persistent Organic Pollutants in offspring neurodevelopment at the age of 4, 6 and 11 years: the “Rhea” mother-child cohort study in Crete

Abstract

Introduction: Persistent organic pollutants (POPs) are considered to be neurotoxic, influencing the synthesis and activity of neurotransmitters and the organization of the developing brain through alterations in basic cellular signaling processes and endocrine function. Human studies on a longitudinal and/or cross-sectional level have associated exposure to POPs in utero and in early childhood with adverse neurodevelopmental outcomes, such as reduced intelligence, ADHD, decreased performance in memory, autism spectrum disorders and other behavioral problems. Inflammation is a complex natural defense mechanism by body tissues in response to injurious stimuli. This response may stop being protective for the organism and become harmful if it occurs chronically. Inflammatory markers, such as cytokines, are proteins involved in normal aspects of neurodevelopment and there is growing evidence associating them in complex, higher order neurological functions, such as cognition and memory. Imbalanced cytokine production, signaling and regulation may have various neurological consequences. A body of research has evolved around the role of prenatal cytokines as markers of risk for cognitive dysfunction in special and vulnerable populations and extensive research findings report that cytokine levels in plasma and/ or sera are altered in neurodevelopmental disorders, e.g. Autism Spectrum Disorders.The specific objectives of this thesis are the following:•To explore the role of high concentration levels of prenatal exposure to HCB, DDE and PCBs in offspring cognitive development at 4, 6 and 11 years of age.•To explore the role of high concentration levels of prenatal exposure to HCB, DDE and PCBs in offspring behavioral and emotional difficulties at 4, 6 and 11 years of age. •To explore the role of high concentration levels of several inflammatory markers (IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17α, MΙP-1α, TNF-α) measured in child serum at 4 years of age in child cognitive development at 4, 6 and 11 years of age.•To explore the role of high concentration levels of several inflammatory markers (IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17α, MΙP-1α, TNF-α) measured in child serum at 4 years of age in child behavioral and emotional difficulties at 4, 6 and 11 years of age.Methods: This study uses data from the Rhea Study, a prospective mother-child cohort established in 2007 in Crete, Greece. Pregnant women were recruited in the study at the time of the first ultrasound examination, around the 12th gestational week, from two public and two private prenatal clinics in Heraklion, during a twelve-month period, from 02/2007 until 02/2008. Trained midwives described in detail the study to pregnant women, obtained written informed consent, measured height, weight, and blood pressure, collected urine and blood samples, and completed a thorough questionnaire concerning participants’ diet, sociodemographic and lifestyle characteristics, and exposure to various environmental agents. Mother-child pairs were invited to participate in child follow-up assessments when the children were 18 months, 4, 6 and 11 years of age.POPs: Maternal serum samples were collected at the first prenatal visit around the 3rd and 4th month of pregnancy, in 10 ml Silicone gel separator vacutainer tubes (Becton Dickinson, UK). Tubes were centrifuged within 2 hours from blood collection at 2500rpm for 10min and were then stored in aliquots at -80°C until assayed. The POP analyses were performed in the National Institute for Health and Welfare, Chemicals and Health Unit, Kuopio, Finland with an Agilent 7000B gas chromatograph triple quadrupole mass spectrometer (GC-MS/MS). Serum concentrations of six individual PCB congeners (IUPAC numbers: 118, 138, 153, 156, 170 and 180), HCB, and DDE were determined. All the results were reported on whole weight and expressed in pg/ml serum, while samples below the limit of quantification (LOQ) were assigned the value 0.5×LOQ. LOQ was 6 pg/ml for PCB118 and PCB156; 10 pg/ml for HCB, DDE, PCB138, PCB153, PCB170, PCB180. We chose to use wet-weight levels for the POPs but adjusted for maternal serum triglycerides and cholesterol as continuous variables in all multivariable models to minimize potential biases associated with automatic lipid adjustment. POPs were treated as categorical variables. We calculated total PCB concentrations by summing the concentrations of the 6 individual PCB congeners and studied the associations of interest for the sum of PCBs. Inflammatory markers: At the 4-year-follow-up assessment, blood samples were collected by venipuncture for each child (10ml) in SST gel separator vacutainer (BD vacutainers, UK), after written parental consent. For the reduction of pain and discomfort of the children, anesthetic cream 5% EMLA with composition 2.5% lidocaine and 2.5% prilocaine (AstraZeneca, UK) was used. Analyses were performed in the Laboratory of Clinical Nutrition and Epidemiology of Diseases of Medical School, University of Crete. Blood samples were centrifuged (Kubota 4000, Japan) at 2500rpm 10min within 2 hours after collection and stored at -80o C until assayed. The Milliplex Map human high sensitivity T cell magnetic bead panel (Cat. # HSTCMAG-28SK) from Millipore (Billerica, MA) was used for the simultaneous quantification of IFN-γ IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17α, MIP-1α and TNF-α in the supernatants. The principle of the assay is based on the quantification of multiple bio-molecules concurrently employing fluorescent-coded magnetic beads (MagPlex-C microspheres). The microspheres were incubated with the samples and then were allowed to pass rapidly through laser systems that distinguish the different sets of microspheres and the fluorescent dyes on the reporter bio-molecules. The sensitivity of the assay for every bio-molecule was: 0.3 pg/ml IFN-γ, 0.1 pg/ml IL-1β, 0.1 pg/ml IL-6, 0.1 pg/ml IL-8, 0.6 pg/ml IL-10, 0.3 pg/ml IL-17α, 0.9 pg/ml MIP-1α and 0.2 pg/ml TNF-α. We used a limit of 4 SD based on the statistical convention that observations 4 or more SD from the expected mean can be considered to be “extreme outliers” and thus, excluded from the statistical analyses. The intra-assay precision (%CV) for all biomolecules was <5%. The inter-assay precision (%CV) for IFNγ, IL-6, IL-10 and IL-17α was <20%, for IL-1β, IL-8, MIP-1α and TNF-α was <15%. The above analyses were performed on an automated analyzer Luminex 100 connected with the Luminex xPONENT software.Cognitive development assessment at 4 years was conducted using the McCarthy Scales of Children’s Abilities (MSCA), which evaluate child development across five domains: verbal, perceptual, quantitative, memory, and motor and offers a composite index of general cognitive development. Cognitive development assessment at 6 years of age was carried out using the Raven’s Colored Progressive Matrices (RCPM), which assess non-verbal general intelligence, the Finger Tapping Test (FTT), which assess motor speed, and the Trail Making Test part A & part B (TMT-Part A & TMT-Part B), which assess visual search, speed of processing, mental flexibility, and executive functions. Cognitive ability at 11 years was carried out using the Wechsler Intelligence Scale for Children, fifth edition (WISC-V), assessing intellectual functioning in children across five Primary Index Scales [including Verbal Comprehension Index (VCI); Visual Spatial Index (VSI); Fluid Reasoning Index (FRI); Working Memory Index (WMI); and Processing Speed Index (PSI)] and the four Ancillary Index Scales [including Quantitative Reasoning Index (QRI); Nonverbal Index (NI); General Ability Index (GAI) and Cognitive Proficiency Index (CPI)]. Behavioral and emotional development were overall assessed through the parent-report questionnaires. At 4 years of age the Attention Deficit Hyperactivity Disorder Test (ADHDT) and the Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ) were completed by participants’ parents. The ADHDT is based on ADHD criteria of DSM-IV and provides 4 indexes, corresponding to 3 subscales (hyperactivity, inattention, impulsivity) and a total ADHD difficulties index. The SDQ is a brief screening questionnaire designed to assess behavioral strengths and difficulties in children and evaluates emotional symptoms, conduct problems, hyperactivity and inattention, peer-relationship problems, and prosocial behaviour. SDQ provides two additional composite indexes of internalizing and externalizing problems. Behavioral and emotional problems at 6and 11 years of age were assessed through Child Behaviour Checklist – Parent Report Form (CBCL) and the Conner’s Parent Rating Scale, Revised, Short Form (CPRS-R: S). The CBCL includes 6 scales that correspond to different diagnostic categories of the DSM-IV: affective problems, anxiety problems, somatic problems, attention deficit/hyperactivity problems, oppositional defiant problems, and conduct problems, and two composite indexes of internalizing and externalizing problems. The CPRS-R: S assess oppositional problems, cognitive problems/inattention, and hyperactivity, and provides an index of total ADHD symptoms.Descriptive analyses on the characteristics of the population, and the distribution of the exposures, and the outcomes were conducted. Generalized additive models were used to assess the linearity of the associations of interest. Multiple linear and logistic regression models were used to explore the associations of interest, accordingly.Results:POPs•High prenatal HCB exposure was associated with decreased performance in i) cognitive, perceptual, executive and working memory functions at the age of 4, ii) non-verbal general intelligence, processing speed and mental flexibility and motor speed at 6 years of age and iii) visual spatial, fluid reasoning, working memory, quantitative reasoning, nonverbal, general ability and cognitive proficiency functions at 11 years of age.•High maternal serum levels of PCBs were associated with offspring decreased performance in working memory tasks at preschool age, increased response time in TMT Part A and lower speed scores in FFT (non-dominant hand) at 6 years of age and lower scores in several WISC-V index scores (working memory, processing speed, quantitative reasoning, nonverbal, general ability and cognitive proficiency) at 11 years of age.•At 11 years of age we found statistically significant positive associations between high HCB levels and three behavioral scales scores in the basic models. However, in the adjusted models the estimates were weakened and it may be possible there is residual confounding implicated in the direction of the results,•No association was demonstrated between high prenatal POPs levels with behavioral outcomes at any age-time point, with the sole exception of the association of high prenatal HCB levels with child peer problems in SDQ at 4 years. •No associations were found between maternal DDE concentrations and neurodevelopmental and behavioral scores at 4 and 11 years of age. Regarding 6 years of assessment, we only found one associations of high prenatal DDE levels with increased response time in TMT Part B.•No indication for effect modification by child sex, maternal pre-pregnancy body mass index (BMI) and maternal TSH during pregnancy was found.Inflammatory Markers•Preschoolers with elevated TNF-α concentrations in serum demonstrated decreased scores in memory, memory span and working memory and preschoolers with high IFN-γ serum levels showed lower scores in memory span scale. Children at 4 years with high levels of IL-8 showed lower prosocial behavior scores. •Children with elevated levels of IFN-γ at 4 years showed increased scores in oppositional and hyperactivity scales, as well as in internalized and externalized CBCL scores at 6 years of age; high IL-1β levels at 4 years were associated with more oppositional symptoms and externalized problems at 6 years of age. We also found that increased TNF-a/IL10 ratio was related with lower inattention and ADHD scores at 6 years.•Children with high levels of IL-8 at 4 years showed increased scores in processing speed; children with high levels of IL6/IL-10 ratio at 4 years showed increased scores in visual spatial performance at 11 years. High levels of the anti-inflammatory IL-10 at 4 years were associated with increased cognitive proficiency scores; high IL6/IL-10 ratio were related to increased general ability scores at 11 years. We also found that children with high levels of IFN-γ at 4 years demonstrated increased scores in hyperactivity and ADHD scales. High IL-17α levels at 4 years were associated with increased internalized problems scales at 11 years.•Our results showed greater risk for reduced verbal performance scores for boys with high IL-17α serum concentration levels, as well as lower motor scores at 4 years for boys with high IL-6 serum concentrations. We also found greater risk for lower scores in memory and memory span scales at 4 years for overweight/obese children with high TNF-α serum concentrations. Conclusions: To conclude, the present thesis supports and extends previous knowledge that prenatal exposure to high levels of POPs can be associated with reduced offspring cognitive development. This is actually the first study highlighting the association between prenatal POPs concentration levels and child neurodevelopment across three different time points, at 4, 6 and 11 years of age, strengthening the evidence for this association. We conclude that those findings raise the possibility that exposure to HCB and PCBs may play a more crucial role in child cognition than previously considered and show new directions for research in birth cohort studies. A deeper understanding of environmental risk factors for impaired cognitive development could be of considerable public health importance because of their potential modifiability. While tens of thousands of industrial chemicals are still in use, evidence on their potential neurodevelopmental effects remains inadequate for the vast majority. Studies like the current one may signify a valuable initial step towards exploring environmental risk factors for cognitive disorders. To our best of knowledge, this the first study conducted in a general population sample of children which highlights the significant role of increased inflammatory levels during preschool years in child cognitive performance across multiple time points. In fact, whilst some studies have examined the possible link between child inflammatory biomarkers and neurodevelopment, most of them were carried out with samples of extremely premature infants or with clinical samples of children with autism spectrum disorders. Moreover, most of those studies have focused on the relationship between maternal inflammatory cytokines during pregnancy and their children's neurodevelopmental outcomes. As there are no studies to this date that explored how inflammatory biomarkers relate to measures of neurodevelopmental scores in a general population sample, these results may shed some light in new pathways of investigation. Our findings reinforce the existing evidence that elevated inflammatory activity may be involved in early pathophysiological processes, such as memory deficits at a cross-sectional level, and in behavioral difficulties at a longitudinal level. An increased understanding of the interactions between pro-and-anti-inflammatory cytokine patterns and levels, and cognitive functions could allow us to identify early at-risk children for targeted interventions and allow every child to meet their full developmental potential. Inflammatory biomarkers could also even serve as indicators and possibly lead to prognosis and therapy in order to prevent developmental delays and behavioral problems in at-risk children.

Εισαγωγή: Οι Επίμονοι Οργανικοί Ρύποι (ΕΟΡ) θεωρούνται νευροτοξικοί, επηρεάζοντας τη σύνθεση και τη δραστηριότητα των νευροδιαβιβαστών και την οργάνωση του αναπτυσσόμενου εγκεφάλου μέσω μεταβολών στις βασικές διαδικασίες κυτταρικής σηματοδότησης και στην λειτουργία του ενδοκρινικού συστήματος. Μελέτες σε ανθρώπους σε διαχρονικό και/ή συγχρονικό επίπεδο έχουν συσχετίσει την έκθεση σε ΕΟΡ εντός της μήτρας και κατά την πρώιμη παιδική ηλικία με δυσμενείς νευροαναπτυξιακές εκβάσεις, όπως μειωμένη νοημοσύνη, ΔΕΠ-Υ, μειωμένη μνημονική επίδοση, διαταραχές του φάσματος του αυτισμού και άλλα συμπεριφορικά προβλήματα. Η φλεγμονή είναι ένας σύνθετος φυσικός αμυντικός μηχανισμός των ιστών του σώματος ως απόκριση σε επιβλαβή ερεθίσματα. Αυτή η απόκριση μπορεί να πάψει να είναι προστατευτική για τον οργανισμό και να γίνει επιβλαβής εάν σημειώνεται σε χρόνιο επίπεδο. Οι δείκτες φλεγμονής, όπως οι κυτοκίνες, είναι πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε φυσιολογικές πτυχές της νευροανάπτυξης και υπάρχουν ολοένα και αυξανόμενα στοιχεία που τους συνδέουν με σύνθετες, ανώτερης τάξης νευρολογικές λειτουργίες, όπως η γνωστική λειτουργία και η μνήμη. Η μη ισορροπημένη παραγωγή, σηματοδότηση και ρύθμιση των κυτοκινών μπορεί να επιφέρει ποικίλες νευρολογικές επιπτώσεις. Ένα σύνολο ερευνών έχει εξελιχθεί γύρω από το ρόλο των προγεννητικών κυτοκινών ως δεικτών κινδύνου για γνωστική δυσλειτουργία σε ειδικούς και ευάλωτους πληθυσμούς και εκτεταμένα ερευνητικά ευρήματα αναφέρουν ότι τα επίπεδα κυτοκινών στο πλάσμα και/ή τους ορούς μεταβάλλονται στις νευροαναπτυξιακές διαταραχές, π.χ. Διαταραχές Αυτιστικού Φάσματος.Οι ειδικοί στόχοι της παρούσας διατριβής είναι οι εξής:• Η διερεύνηση του ρόλου των προγεννητικά υψηλών επιπέδων συγκέντρωσης HCB, DDE και PCBs στη γνωστική ανάπτυξη των παιδιών σε ηλικία 4, 6 και 11 ετών.• Η διερεύνηση του ρόλου των προγεννητικά υψηλών επιπέδων συγκέντρωσης HCB, DDE και PCBs στις συμπεριφορικές και συναισθηματικές δυσκολίες των παιδιών σε ηλικία 4, 6 και 11 ετών.• Η διερεύνηση του ρόλου των υψηλών επιπέδων συγκέντρωσης δεικτών φλεγμονής (IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17α, MΙP-1α, TNF-α) οι οποίοι μετρώνται στον ορό των παιδιών στην ηλικία των 4 ετών στη γνωστική τους ανάπτυξη σε ηλικία 4, 6 και 11 ετών.• Η διερεύνηση του ρόλου των υψηλών επιπέδων συγκέντρωσης δεικτών φλεγμονής (IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17α, MΙP-1α, TNF-α) που μετρώνται στον ορό των παιδιών στην ηλικία των 4 ετών στις συμπεριφορικές και συναισθηματικές δυσκολίες τους σε ηλικία 4, 6 και 11 ετών.Μέθοδος: Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιεί δεδομένα από τη Μελέτη Ρέα, μια προοπτική μελέτη κοόρτης μητέρας-παιδιού που ξεκίνησε το 2007 στην Κρήτη. Στη μελέτη προσεγγίστηκαν έγκυες γυναίκες κατά την επίσκεψή τους για την πρώτη εξέταση υπερήχου, περίπου κατά την 12η εβδομάδα κύησης, σε δύο δημόσιες και δύο ιδιωτικές μαιευτικές κλινικές του Ηρακλείου, κατά τη διάρκεια δωδεκάμηνης περιόδου, από 02/2007 έως 02/2008. Εκπαιδευμένες μαίες περιέγραψαν λεπτομερώς τη μελέτη στις έγκυες γυναίκες, έλαβαν γραπτή συγκατάθεση, μέτρησαν ύψος, βάρος και αρτηριακή πίεση, συνέλεξαν δείγματα ούρων και αίματος και συμπλήρωσαν ένα περιεκτικό ερωτηματολόγιο σχετικά με τη διατροφή των συμμετεχουσών, τα κοινωνικοδημογραφικά χαρακτηριστικά και τα χαρακτηριστικά του τρόπου ζωής και την έκθεση σε ποικίλους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Τα ζεύγη μητέρας-παιδιού προσκλήθηκαν να συμμετάσχουν σε αξιολογήσεις παρακολούθησης της ανάπτυξης των παιδιών όταν εκείνα ήταν 18 μηνών, 4, 6 και 11 ετών.POPs: Δείγματα μητρικού ορού κατά την πρώτη προγεννητική επίσκεψη γύρω στον 3ο και 4ο μήνα της εγκυμοσύνης συνελέχθησαν, σε φιαλίδια των 10 ml με γέλη σιλικόνης για διαχωρισμό (Becton Dickinson, UK). Τα φιαλίδια φυγοκεντρήθηκαν εντός 2 ωρών από τη συλλογή αίματος στα 2500 rpm για 10 λεπτά και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε δείγματα στους -80°C μέχρι την ανάλυσή τους. Οι αναλύσεις των ΕΟΡ πραγματοποιήθηκαν στο National Institute for Health and Welfare, Chemicals and Health Unit, στο Kuopio της Φινλανδίας με φασματογράφο μάζας τριπλού τετραπόλου αερίου χρωματογράφου Agilent 7000B (GC-MS/MS). Προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις στον ορό έξι μεμονωμένων ισομερών PCBs (IUPAC numbers: 118, 138, 153, 156, 170 και 180), HCB και DDE. Όλα τα αποτελέσματα περιγράφηκαν σε ολικό βάρος και εκφράστηκαν σε pg/ml ορού, ενώ στα δείγματα κάτω από το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) αποδόθηκε η τιμή 0,5×LOQ. Το LOQ ήταν 6 pg/ml για τα PCB118 και PCB156, 10 pg/ml για HCB, DDE, PCB138, PCB153, PCB170, PCB180. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε επίπεδα νωπού βάρους για τους ΕΟΡ, αλλά προσαρμοσμένα για τα τριγλυκερίδια και τη χοληστερόλη του μητρικού ορού ως συνεχείς μεταβλητές σε όλα τα πολυπαραγοντικά μοντέλα προκειμένου να ελαχιστοποιήσουμε πιθανά σφάλματα μεροληψίας που σχετίζονται με την αυτόματη προσαρμογή των λιπιδίων. Οι ΕΟΡ αντιμετωπίστηκαν ως κατηγορικές μεταβλητές. Υπολογίσαμε τις συνολικές συγκεντρώσεις PCB αθροίζοντας τις συγκεντρώσεις των 6 μεμονωμένων PCB ισομερών και μελετήσαμε τις σχέσεις που μας ενδιαφέρουν για το άθροισμα των PCBs.Δείκτες φλεγμονής: Στην αξιολόγηση παρακολούθησης των 4 ετών, συνελέχθησαν δείγματα αίματος με φλεβοκέντηση για κάθε παιδί (10 ml) σε φιαλίδια SST με γέλη σιλικόνης για διαχωρισμό (BD vacutainers, UK), μετά από γραπτή συγκατάθεση των γονέων. Για τη μείωση του πόνου και της δυσφορίας των παιδιών χρησιμοποιήθηκε αναισθητική κρέμα 5% EMLA με σύνθεση 2,5% λιδοκαΐνη και 2,5% πριλοκαΐνη (AstraZeneca, UK). Οι αναλύσεις έλαβαν χώρα στο Εργαστήριο Κλινικής Διατροφής και Επιδημιολογίας Νοσημάτων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Κρήτης. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν (Kubota 4000, Ιαπωνία) στα 2500 rpm για 10 λεπτά εντός 2 ωρών μετά τη συλλογή και φυλάχθηκαν στους -80°C έως ότου αναλυθούν. To Milliplex Map human high sensitivity T cell magnetic bead panel (Cat. # HSTCMAG-28SK) από το Millipore (Billerica, MA) χρησιμοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των IFN-γ IL-1β, IL-6, IL-8, IL- 10, IL-17α, ΜΙΡ-1α και TNF-α στα υπερκείμενα υγρά. Η αρχή της ανάλυσης βασίζεται στον ποσοτικό προσδιορισμό πολλαπλών βιομορίων χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα μαγνητικά σφαιρίδια με κωδικοποίηση φθορισμού (μικροσφαιρίδια MagPlex-C). Τα μικροσφαιρίδια επωάστηκαν με τα δείγματα και στη συνέχεια αφέθηκαν να περάσουν γρήγορα μέσα από συστήματα λέιζερ τα οποία διακρίνουν τα διαφορετικά σύνολα μικροσφαιριδίων και τις φθορίζουσες βαφές στα βιομόρια αναφοράς. Η ευαισθησία της ανάλυσης για κάθε βιομόριο ήταν: 0,3 pg/ml IFN-γ, 0,1 pg/ml IL-1β, 0,1 pg/ml IL-6, 0,1 pg/ml IL-8, 0,6 pg/ml IL- 10, 0,3 pg/ml IL-17α, 0,9 pg/ml ΜΙΡ-1α και 0,2 pg/ml ΤΝΡ-α. Χρησιμοποιήσαμε ένα όριο 4 SD βάσει της στατιστικής συνθήκης ότι οι παρατηρήσεις 4 ή περισσότερων SD από τον αναμενόμενο μέσο όρο μπορούν να θεωρηθούν ως «έντονα ακραίες τιμές» και, επομένως, να εξαιρεθούν από τις στατιστικές αναλύσεις. Η επαναληπτικότητα (%CV) για όλα τα βιομόρια ήταν <5%. Η αναπαραγωγιμότητα (%CV) για IFNγ, IL-6, IL-10 και IL-17α ήταν <20%, για IL-1β, IL-8, MIP-1α και TNF-α ήταν <15%. Οι παραπάνω αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε έναν αυτοματοποιημένο αναλυτή Luminex 100 συνδεδεμένο με το λογισμικό Luminex xPONENT.Η αξιολόγηση της γνωστικής ικανότητας στα 4 έτη πραγματοποιήθηκε με την κλίμακα McCarthy Scales of Children’s Abilities (MSCA), η οποία αξιολογεί την ανάπτυξη σε 5 τομείς: τον λεκτικό, τον αντιληπτικό, τον αριθμητικό, το μνημονικό και τον κινητικό τομέα. Η αξιολόγηση της γνωστικής ανάπτυξης στα 6 έτη έγινε με την κλίμακα Raven’s Colored Progressive Matrices (RCPM), το οποίο εξετάζει τη μη-λεκτική γενική γνωστική ικανότητα, το Finger Tapping Test (FTT), το οποίο μετράει τη κινητική ταχύτητα και το Trail Making Test μέρος A & μέρος B (TMT-Part A & TMT-Part B), που αξιολογούν την οπτική αναζήτηση, την ταχύτητα επεξεργασίας, τη νοητική ευελιξία και τις επιτελικές λειτουργίες. Η γνωστική ικανότητα στα 11 έτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της κλίμακας Wechsler Intelligence Scale for Children, πέμπτη έκδοση (WISC-V), η οποία αξιολογεί τη διανοητική λειτουργία σε παιδιά σε πέντε Κλίμακες Πρωτογενών Δεικτών (συμπεριλαμβανομένου του Δείκτη Λεκτικής Κατανόησης, του Οπτικοχωρικού Δείκτη, το Δείκτη Ρέοντος Συλλογισμού, του Δείκτη Μνήμης Εργασίας και του Δείκτη Ταχύτητας Επεξεργασίας) και σε τέσσερις Κλίμακες Βοηθητικών Δεικτών (συμπεριλαμβανομένου του Δείκτη Ποσοτικού Συλλογισμού, του Μη Λεκτικού Δείκτη, του Δείκτη Γενικής Ικανότητας και του Δείκτη Γνωστικής Επάρκειας). Η συμπεριφορική και συναισθηματική ανάπτυξη αξιολογήθηκε γενικά με ερωτηματολόγια αναφοράς συμπτωμάτων από τους γονείς. Στα 4 έτη χρησιμοποιήθηκε το ερωτηματολόγιο Attention Deficit Hyperactivity Disorder Test (ADHDT) και το Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ). Το ADHDT βασίζεται στα κριτήρια του DSM-IV και παρέχει 3 δείκτες που αξιολογούν την υπερκινητικότητα, τη διάσπαση προσοχής και την παρορμητικότητα και έναν δείκτη γενικής αξιολόγησης των δυσκολιών ΔΕΠ-Υ. Το SDQ αποτελεί ένα σύντομο ερωτηματολόγιο εντοπισμού συμπεριφορικών δεξιοτήτων και δυσκολιών και αξιολογεί τα συναισθηματικά συμπτώματα, τα προβλήματα διαγωγής, την υπερκινητικότητα και τη διάσπαση προσοχής, τα προβλήματα με τους συνομηλίκους και την προκοινωνική συμπεριφορά. Το SDQ παρέχει επίσης δύο σύνθετους δείκτες που αξιολογούν τα εσωτερικευμένα και εξωτερικευμένα προβλήματα. Τα συμπεριφορικά και συναισθηματικά προβλήματα στα 6 και 11 έτη αξιολογήθηκαν με το ερωτηματολόγιο Child Behaviour Checklist – Parent Report Form (CBCL) και με το Conner’s Parent Rating Scale, Revised, Short Form (CPRS-R: S). Το CBCL περιλαμβάνει 6 κλίμακες που αξιολογούν διαφορετικές διαγνωστικές κατηγορίες του DSM-IV: συναισθηματικά προβλήματα, προβλήματα άγχους, σωματικά προβλήματα, διάσπαση προσοχής/υπερκινητικότητα, εναντιωματικά/προκλητικά προβλήματα, και προβλήματα διαγωγής, και επίσης παρέχει δύο σύνθετους δείκτες που αξιολογούν τα εσωτερικευμένα και εξωτερικευμένα προβλήματα. Το CPRS-R: S αξιολογεί εναντιωματικά προβλήματα, γνωστικά προβλήματα/διάσπαση προσοχής και υπερκινητικότητα και παρέχει έναν γενικό δείκτη αξιολόγησης των δυσκολιών ΔΕΠ-Υ.Γενικευμένα αθροιστικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της γραμμικότητας των υπό μελέτη σχέσεων. Στις αναλύσεις για τη διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ των εκθέσεων και των εκβάσεων περιλαμβάνονται περιγραφικές μέθοδοι στατιστικής και πολυπαραγοντικά μοντέλα γραμμικής και λογιστικής παλινδρόμησης ανάλογα με το είδος των μεταβλητών στις υπο εξέταση σχέσεις.Αποτελέσματα:ΕΟΡ•Η υψηλή προγεννητική έκθεση σε HCB σχετίστηκε με i) χαμηλότερη επίδοση σε γνωστική, αντιληπτική, επιτελική λειτουργία και λειτουργία μνήμης εργασίας στην ηλικία των 4 ετών, ii) μη λεκτική ικανότητα, γενική ικανότητα, ταχύτητα επεξεργασίας και νοητική ευελιξία και κινητική ταχύτητα σε ηλικία 6 ετών και iii) χαμηλότερες επιδόσεις σε λειτουργίες οπτικοχωρικής ικανότητας, ρέοντος συλλογισμού, μνήμης εργασίας, ποσοτικού συλλογισμού, μη λεκτικής, γενικής ικανότητας και γνωστικής επάρκειας στην ηλικία των 11 ετών.•Τα υψηλά επίπεδα PCBs στον ορό της μητέρας σχετίστηκαν με μειωμένη επίδοση των παιδιών σε δοκιμασίες μνήμης εργασίας στην προσχολική ηλικία, με αυξημένο χρόνο απόκρισης στο TMT Μέρος Α και χαμηλότερες βαθμολογίες ταχύτητας στο FFT (μη-κυρίαρχο χέρι) στην ηλικία των 6 ετών.•Τα υψηλά επίπεδα PCBs προγεννητικά σχετίστηκαν με χαμηλότερες βαθμολογίες σε ποικίλες βαθμολογίες δεικτών του WISC-V (μνήμη εργασίας, ταχύτητα επεξεργασίας, ποσοτικός συλλογισμός, μη λεκτική ικανότητα, γενική ικανότητα και γνωστική επάρκεια) στην ηλικία των 11 ετών.•Στην ηλικία των 11 ετών βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές θετικές σχέσεις μεταξύ των υψηλών επιπέδων HCB και των βαθμολογιών τριών κλιμάκων συμπεριφοράς στα βασικά μοντέλα. Ωστόσο, στα προσαρμοσμένα μοντέλα οι δείκτες εκτίμησης ήταν αποδυναμωμένοι και ενδέχεται να υφίσταται η ύπαρξη πρόσθετων συγχυτικών παραγόντων που να εμπλέκονται στην κατεύθυνση των αποτελεσμάτων.•Δεν καταδείχθηκε σχέση μεταξύ των υψηλών επιπέδων ΕΟΡ προγεννητικά με συμπεριφορικές εκβάσεις σε οποιοδήποτε ηλικιακό χρονικό σημείο, με μοναδική εξαίρεση τη σχέση υψηλών προγεννητικών επιπέδων HCB με προβλήματα μεταξύ συνομηλίκων στο SDQ στα 4 έτη.•Δεν βρέθηκαν σχέσεις μεταξύ των μητρικών συγκεντρώσεων DDE και των νευροαναπτυξιακών και συμπεριφορικών βαθμολογιών στην ηλικία των 4 και 11 ετών. Αναφορικά με την αξιολόγηση στα 6 έτη, βρέθηκε μόνο μία σχέση υψηλών επιπέδων DDE προγεννητικά με τον αυξημένο χρόνο απόκρισης στο TMT Μέρος Β.•Δεν βρέθηκαν σημαντικές ενδείξεις για τροποποίηση της επίδρασης ανάλογα με το φύλο του παιδιού, τον δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ) πριν από την εγκυμοσύνη και την TSH της μητέρας κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης.Δείκτες Φλεγμονής•Τα παιδιά προσχολικής ηλικίας με αυξημένες συγκεντρώσεις TNF-α στον ορό σημείωσαν μειωμένες βαθμολογίες στις δοκιμασίες μνήμης, εύρους μνήμης και μνήμης εργασίας και τα παιδιά προσχολικής ηλικίας με υψηλά επίπεδα IFN-γ στον ορό σημείωσαν χαμηλότερες βαθμολογίες στην κλίμακα του εύρους μνήμης. Τα παιδιά ηλικίας 4 ετών με υψηλά επίπεδα IL-8 εμφάνισαν χαμηλότερες βαθμολογίες σε κλίμακα προκοινωνικής συμπεριφοράς.•Τα παιδιά με αυξημένα επίπεδα IFN-γ στα 4 έτη σημείωσαν αυξημένες βαθμολογίες στις κλίμακες εναντιωματικών προβλημάτων και υπερκινητικότητας, καθώς και στις βαθμολογίες εσωτερικευμένων και εξωτερικευμένων προβλημάτων του CBCL στην ηλικία των 6 ετών. Τα υψηλά επίπεδα IL-1β στα 4 έτη σχετίστηκαν με περισσότερα εναντιωματικά συμπτώματα και εξωτερικευμένα προβλήματα στην ηλικία των 6 ετών. Βρέθηκε, επίσης, ότι ο αυξημένος λόγος TNF-a/IL10 σχετιζόταν με χαμηλότερες βαθμολογίες διάσπασης προσοχής και ΔΕΠ-Υ στα 6 έτη.•Τα παιδιά με υψηλά επίπεδα IL-8 στα 4 έτη παρουσίασαν αυξημένες βαθμολογίες στην ταχύτητα επεξεργασίας. Τα παιδιά με υψηλά επίπεδα λόγου IL6/IL-10 στα 4 έτη παρουσίασαν αυξημένες βαθμολογίες στην οπτικοχωρική επίδοση στα 11 έτη. Τα υψηλά επίπεδα της αντιφλεγμονώδους IL-10 στα 4 έτη σχετίστηκαν με αυξημένες βαθμολογίες γνωστικής επάρκειας. Ο υψηλός λόγος IL6/IL-10 σχετίστηκε με αυξημένες βαθμολογίες γενικής ικανότητας στα 11 έτη. Βρήκαμε, επίσης, ότι τα παιδιά με υψηλά επίπεδα IFN-γ στα 4 έτη παρουσίασαν αυξημένες βαθμολογίες στις κλίμακες υπερκινητικότητας και ΔΕΠ-Υ. Τα υψηλά επίπεδα IL-17α στα 4 έτη σχετίστηκαν με αυξημένες κλίμακες εσωτερικευμένων προβλημάτων στα 11 έτη.•Τα αποτελέσματά μας κατέδειξαν μεγαλύτερο κίνδυνο για μειωμένες βαθμολογίες λεκτικής επίδοσης για τα αγόρια με υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης IL-17α στον ορό, καθώς και χαμηλότερες κινητικές βαθμολογίες στα 4 έτη για τα αγόρια με υψηλές συγκεντρώσεις IL-6. Βρήκαμε επίσης μεγαλύτερο κίνδυνο για χαμηλότερες βαθμολογίες στις κλίμακες μνήμης και εύρους μνήμης στα 4 χρόνια για τα υπέρβαρα/παχύσαρκα παιδιά με υψηλές συγκεντρώσεις TNF-α στον ορό.Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή υποστηρίζει και επεκτείνει την προηγούμενη γνώση ότι η προγεννητική έκθεση σε υψηλά επίπεδα ΕΟΡ μπορεί να σχετιστεί με μειωμένη γνωστική ανάπτυξη παιδιών. Στην πραγματικότητα, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που υπογραμμίζει τη σχέση μεταξύ των επιπέδων συγκέντρωσης ΕΟΡ προγεννητικά και της παιδικής νευροανάπτυξης σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία, στα 4, 6 και 11 έτη, ενισχύοντας τα επιστημονικά στοιχεία για αυτή τη συσχέτιση. Συμπεραίνουμε ότι αυτά τα ευρήματα αυξάνουν την πιθανότητα ότι η έκθεση σε HCB και PCBs μπορεί να διαδραματίσει κρισιμότερο ρόλο στη γνωστική λειτουργία του παιδιού από ό,τι είχε θεωρηθεί προηγουμένως και καταδεικνύουν νέες ερευνητικές κατευθύνσεις στις μελέτες κοόρτης. Η βαθύτερη κατανόηση των περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου για την μειωμένη γνωστική ανάπτυξη θα μπορούσε να έχει αξιοσημείωτη σημασία για τη δημόσια υγεία λόγω της δυνατότητας τροποποίησης αυτών. Ενώ δεκάδες χιλιάδες βιομηχανικές χημικές ουσίες εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται, τα διαθέσιμα στοιχεία για τις πιθανές νευροαναπτυξιακές τους επιπτώσεις παραμένουν ανεπαρκή για τη συντριπτική πλειοψηφία. Μελέτες όπως η τρέχουσα είναι δυνατό να σηματοδοτήσουν ένα πολύτιμο αρχικό βήμα προς τη διερεύνηση περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου για τις γνωστικές διαταραχές.Από όσο γνωρίζουμε, πρόκειται για την πρώτη μελέτη που διεξήχθη σε δείγμα γενικού πληθυσμού παιδιών, η οποία υπογραμμίζει τον σημαντικό ρόλο των αυξημένων επιπέδων φλεγμονής κατά την προσχολική ηλικία στη γνωστική επίδοση του παιδιού σε πολλαπλά χρονικά σημεία. Πράγματι, ενώ ορισμένες μελέτες έχουν εξετάσει την πιθανή σχέση μεταξύ βιοδεικτών φλεγμονής στα παιδιά και της νευροανάπτυξης, οι περισσότερες από αυτές πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα εξαιρετικά πρόωρων βρεφών ή σε κλινικά δείγματα παιδιών με διαταραχές του φάσματος του αυτισμού. Επιπλέον, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη σχέση μεταξύ των μητρικών δεικτών φλεγμονής κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και των νευροαναπτυξιακών εκβάσεων των παιδιών τους. Καθώς μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν μελέτες που να διερευνούν τον τρόπο που οι δείκτες φλεγμονής σχετίζονται με τις μετρήσεις των νευροαναπτυξιακών βαθμολογιών σε ένα δείγμα γενικού πληθυσμού, τα αποτελέσματα αυτά δύνανται να φωτίσουν νέα ερευνητικά μονοπάτια. Τα ευρήματά μας ενισχύουν τα υπάρχοντα στοιχεία ότι η αυξημένη φλεγμονώδης δραστηριότητα μπορεί να εμπλέκεται σε πρώιμες παθοφυσιολογικές διεργασίες, όπως ελλείμματα μνήμης σε συγχρονικό επίπεδο, και σε δυσκολίες συμπεριφοράς σε διαχρονικό επίπεδο. Η καλύτερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μοτίβων και των επιπέδων των προ-και-αντιφλεγμονωδών κυτοκινών και των γνωστικών και συμπεριφορικών λειτουργιών θα μπορούσε να μας επιτρέψει να εντοπίσουμε παιδιά σε πρώιμο κίνδυνο για στοχευμένες παρεμβάσεις και να επιτρέψει σε κάθε παιδί να εκπληρώσει το πλήρες αναπτυξιακό του δυναμικό. Οι φλεγμονώδεις βιοδείκτες θα μπορούσαν, επίσης, να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί δείκτες και πιθανώς να οδηγήσουν σε προσεγγίσεις πρόληψης και θεραπείας αναπτυξιακών καθυστερήσεων και διαταραχών συμπεριφοράς για παιδιά σε κίνδυνο.