Μελέτη της αλκοολικής ζύμωσης με χρήση ζυμών non-Saccharomyces

Abstract

Beer is a unique product with special sensory characteristics, which consists of four main ingredients: water, malt, hops and yeasts. The demand for mass production of beer has led to the selection and use of specific Saccharomyces strains, which may exhibit high efficiency, but limit the variation in metabolic pathways that could provide new and interesting sensory characters to the final product.With the rapid development of microbreweries on a global scale, brewers have tried to differentiate their products by choosing alternative malts and hops, with the ultimate goal being the enrichment of their products in aromas and flavors. One way to establish this goal is the selection of different yeasts, since their metabolism is one of the main factors that determine the sensory profile of beer. Originally known from the wine industry as spoilage microorganisms, non-Saccharomyces or "wild" yeasts, are now the main choice due to the aromatic and taste complexity they provide in the final product. Similar opinions, regarding the alteration of the final product, prevailed in the Brewing industry, although in some beer types, such as Lambic, their use is imperative even in mixed fermentations of different genera. Nowadays, there is a great deal of interest in the use of non-Saccharomyces in the brewing industry, which through various metabolic pathways, can produce a number of substances that affect and contribute to the aromatic profile.The purpose of this dissertation was to produce an innovative beers using non-Saccharomyces yeast strains, which would differentiate from the corresponding conventional products due to its aromatic complexity. In addition to the differentiated aromatic profile, it is essential for the used strain to metabolize the main sugars of wort (glucose, fructose and maltose) in order to produce ethanol. For this purpose, after literature review in studies conducted in wine fermentations, two non-Saccharomyces yeasts were selected, Torulaspora delbrueckii (T.d.) and Metschnikowia pulcherrima (M.p.) as alternative yeasts to Saccharomyces cerevisiae (S.c.). More specifically, two commercial strains of T. delbrueckii, 291 (Lallemand) and Prelude (Hansen), and a commercial strain of M. pulcherrima (Flavia MP346, Lallemand), were evaluated in comparison to a strain of S. cerevisiae (US-05, Fermentis by Lesaffre). The research focused on the evaluation of the ability of these strains to ferment the main sugars of the wort, to measure the produced ethanol, the consumption of free amino nitrogen and to investigate the effect of fermentation temperature on the kinetics of fermentation. Hence, the fermentations were conducted in two different temperatures, 13 and 20 °C, while the volatile compounds produced in each sugar were also studied. Based on the above, synthetic substrates of glucose, fructose, maltose and a mixture of the aforementioned sugars were produced in proportions corresponding to those of a typical wort (86% maltose, 9% glucose and 5% fructose) and fermented at 13 and 20 °C, in order to study the fermentation kinetics. Results showed that all studied strains are able to metabolize all sugars, producing a sufficient amount of ethanol and grew at both temperatures, but at a slower rate at 13 °C. Glucose intake was faster than fructose, for T. delbrueckii 291 at 20 °C, and for T. delbrueckii Prelude at 13 °C. Maltose showed a lower rate of consumption compared to monosaccharides, especially at lower temperature, without affecting the concentration of residual sugars. In T. delbrueckii 291 fermentation, a lag phase is observed during the metabolism of maltose, and also during its growth, which is due to the difficulty of this strain to activate the maltase enzyme. In M. pulcherrima, maltose is consumed more slowly compared to the two monosaccharides (glucose and fructose), with a lower metabolic rate and a slight delay in the beginning of fermentation.In the present study the Monod model was used due to its simplicity and ease of adaptation to the experimental data. The model is able to predict the biomass growth rate for conventional yeast and T. delbrueckii Prelude, as the experimental results of cell growth exhibited a satisfactory fit. However, it does not show a satisfactory fit for T. delbrueckii 291, especially at 13 °C. Generally, T. delbrueckii 291 presented the maximum specific growth rate in the two monosaccharides at 20 ° C, followed by the strain of M. pulcherrima. Similar results were observed at the lower studied temperature, with no significant difference in k-values. The maximum cell growth of all non-conventional yeasts was significantly higher (p <0.05) than that of S.c US-05 at all fermentable sugars and fermentation temperatures. Cell yield was found to be higher in T. delbrueckii 291 in the two monosaccharides. As for the mixed sugars fermentations, the maximum cell growth is observed at 20 °C in the fermentations of T. delbrueckii 291 and M. pulcherrima. At 13 °C, non-Saccharomyces show higher cell growth than S. cerevisiae US-05, as well.Temperature had a significant effect (p <0.05) on ethanol yield. More specifically, wild yeasts produced quantities of ethanol equal to or higher than the conventional yeast. In particular, at 13 ° C, the concentration of ethanol produced by M.pulcherrima (40 g/L) in maltose fermentation was significantly higher (p <0.05), surpassing the other yeasts. In contrast, at 20 ° C, a higher concentration was produced by S. cerevisiae US-05 (43 g / L).Additionally, the final concentration of free amino nitrogen was significantly different (p <0.05) between the studied strains and the fermentation temperatures. The greatest need for nitrogen was observed in M. pulcherrima at all sugars at both temperatures, while between T. delbrueckii strains, the consumption was higher for T. delbrueckii 291.The volatile compounds were affected by the fermentation temperature and the sugar used (p<0.05), while all strains produced higher alcohols, medium chain fatty acids and their corresponding esters in the fermentation of maltose and mixed sugars. More specifically, the two T. delbrueckii strains exhibited high values of phenylethyl alcohol, in different sugars each, T. delbrueckii 291 in maltose, while T. delbrueckii Prelude to the sugar mixture at 20 °C. Similar results are presented in the fermentations of M. pulcherrima, with the later exhibiting the highest values in fructose and mixed sugars substrate. At 13 °C, the wild strains showed higher concentrations of fatty acid esters than S. cerevisiae US-05, and at the same time, more esters were detected compared to 20 °C. According to the results of the GC-MS analysis, T. delbrueckii 291 produced the maximum concentrations at 20 °C, while T. delbrueckii Prelude at 13 °C. In terms of fermentation with M. pulcherrima, higher production of medium chain fatty acid esters was observed at lower temperature fermentation. As for the sugars, most of the esters were detected in the mixed sugars fermented by the two T. delbrueckii strains, while for M. pulcherrima in fructose.After the fermentation of the main sugars was ascertained, the production of an American Pale Ale type of beers with initial density values of 12.2±0.1 °P and pH 5.1. ±0.1 was conducted. In these experiments different beers were fermented with monocultures of the studied yeasts (S.c. US-05, T.d. 291, T.d. Prelude and M. p.), as well as with mixed cultures of conventional yeast with each strain of T. delbrueckii in a ratio of 1:10 and with M. pulcherrima in ratios of 1: 1 and 1:10, respectively, at 13 and 20 ° C. In particular, the ratio of 1:10 was chosen based on the literature review, as it has been found that S. cerevisiae and T. delbrueckii grow in parallel without competition, and can provide a very interesting aromatic profile with high percentages of ethanol. Regarding M. pulcherrima, it has not yet been tested in beer production, so it was considered useful to examine it in different proportions, as to, also, study in detail the fermentation kinetics, the competitiveness between the two microorganisms as well as the characteristics of the beers produced.Although the non-Saccharomyces yeasts showed lower fermentation rates than S. cerevisiae US-05, they were capable of producing American Pale Ale beer, both in mono- and mixed cultures at both temperatures (13 and 20 °C). Monoculture T. delbrueckii 291 had the slowest metabolic rate at both temperatures, presenting a similar lag phase observed in synthetic substrates fermentation. The consumption of FAN was rapid at low temperature for all non-Saccharomyces yeasts, as they were in need due to survival from the low fermentation temperature as well as the stress of disaccharide. Regarding the M. pulcherrima fermentations, at 20 °C, the ratio 1:1, showed a similar metabolic rate to the conventional yeast, indicating that in this mixed fermentation S. cerevisiae US-05 prevailed.The mixed fermentations of non-conventional yeasts produced similar ethanol concentration to S. cerevisiae US-05, especially at 20 °C. The only exemption was the mixed fermentation of T. delbrueckii Prelude, whose ethanol production (5.40 ± 0.10% ABV) significantly exceeded (p <0.05) S. cerevisiae US-05. The monocultures produced lower ethanol at both temperatures. In addition, the color and bitterness of the produced beers were measured at the end of the fermentation, as well as after a period of 30 days. After this period, it was observed that flocculation was greater in mixed fermentations than monocultures due to the presence of S. cerevisiae US-05. Among the strains examined, the monocultures of T. delbrueckii showed higher values in color, compared to M. pulcherrima, while the values in bitterness did not show significant difference in most fermentations.In terms of flavor produced, the mixed fermentation of T. delbrueckii 291 presented the most aromatic profile at low fermentation temperature, with more fruity notes and floral aromas, while T. delbrueckii Prelude demonstrated that at 20 °C. Regarding the M. pulcherrima strain, monoculture was significantly different (p<0.05) from S. cerevisiae US-05, especially at higher temperature, presenting a promising sensory profile, as it can enhance the beer with more fruity, but also phenolic notes, since in the case of this strain, the highest concentration of 2-methoxy-4-vinyl-guaiacol was detected.Finally, all the beers produced, unfiltered and unsterilized, were aged in a custom chamber at 13 °C for two years. At specific time intervals (1 month, 6 months, 1 and 2 years) samples were collected to study the evolution of aromatic compounds during ageing. In general, no off-flavor compound, such as the characteristic trans-2-nonenal, was detected but the beers were altered aromatically. The volatile compounds produced at 13 °C increased only during the yeast autolysis, with no ageing compounds detected. In contrast, at 20 °C fermentations, the changes were significant (p <0.05), especially for the mono- and mixed fermentation of T. delbrueckii 291. In M. pulcherrima fermentations, most significant changes were shown in monoculture, while the two examined ratios in mixed cultures fermentations did not differ. Changes in volatile compounds in S. cerevisiae US-05 were observed at 20 °C fermentation, with a significant increase in higher alcohols as well as in medium chain fatty acid esters. At low temperature, hydrolysis of esters was observed in all beers, which may have been the main reason for the loss of the fruity character during storage. In general, in wild fermentations, fruity as well as flower aromas were transformed into aromas of stone fruits, such as apricot and peach, as well as caramel, which is attributed to the increase of ethyl esters and the detection of new volatiles, i.e. lactones. To conclude with, the studied wild yeasts are able to produce innovative beer products with unique sensory characteristics, and, therefore, they present a viable solution when microbreweries want to differ based on the sensory characters of their products.

Η μπίρα είναι ένα μοναδικό προϊόν με ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, η οποία αποτελείται από τέσσερα βασικά συστατικά: το νερό, τη βύνη, το λυκίσκο και τη ζύμη. Η απαίτηση για μαζική παραγωγή της, οδήγησε στην επιλογή και τη χρήση συγκεκριμένων στελεχών Saccharomyces, τα οποία εμφανίζουν υψηλή αποδοτικότητα, χωρίς ωστόσο να προσφέρουν πολυπλοκότητα αρώματος και γεύσης στο τελικό προϊόν. Με τη ραγδαία ανάπτυξη των μικροζυθοποιείων σε παγκόσμια κλίμακα, οι ζυθοποιοί προσπάθησαν να διαφοροποιήσουν τα προϊόντα τους επιλέγοντας εναλλακτικές βύνες και λυκίσκους, με απώτερο σκοπό τον εμπλουτισμό των προϊόντων τους σε αρώματα και γεύση. Ένας από τους τρόπους είναι και η επιλογή διαφορετικών ζυμομυκήτων, δεδομένου ότι ο μεταβολισμός τους, είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που καθορίζουν το οργανοληπτικό προφίλ του ζύθου. Γνωστοί αρχικά από τον κλάδο της Οινολογίας ως μικροοργανισμοί αλλοίωσης, οι non-Saccharomyces ή «άγριες» ζύμες, αποτελούν κύρια επιλογή πλέον λόγω της αρωματικής και γευστικής πολυπλοκότητας που προσδίδουν στους οίνους. Αντίστοιχες απόψεις, όσον αφορά στην αλλοίωση του τελικού προϊόντος, επικρατούσαν και στον κλάδο της Ζυθοποιίας, αν και σε ορισμένα στυλ μπίρας, όπως τις Lambic, η χρήση τους είναι επιτακτική ακόμη και σε μικτές ζυμώσεις με διαφορετικά γένη. Σήμερα, μεγάλο ενδιαφέρον παρατηρείται για τη χρήση των non-Saccharomyces στον κλάδο της ζυθοποίησης, οι οποίοι μέσα από διάφορα μεταβολικά μονοπάτια που ακολουθούν για τον μεταβολισμό των σακχάρων του ζυθογλεύκους, μπορούν να παράξουν ένα πλήθος ουσιών που επιδρούν και συνεισφέρουν στο αρωματικό προφίλ του ζύθου. Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η παραγωγή καινοτόμου ζύθου με τη χρήση στελεχών non-Saccharomyces, ο οποίος θα διαφοροποιούνταν από τα αντίστοιχα συμβατικά προϊόντα λόγω της αρωματικής του πολυπλοκότητας. Εκτός του διαφοροποιημένου αρωματικού προφίλ, είναι αναγκαίο το χρησιμοποιούμενο στέλεχος να έχει τη δυνατότητα να μεταβολίζει τα βασικά σάκχαρα του ζυθογλεύκους (γλυκόζη, φρουκτόζη και μαλτόζη) προκειμένου να παραχθεί αιθανόλη. Για αυτό το σκοπό, έπειτα από βιβλιογραφική ανασκόπηση σε μελέτες που διεξήχθησαν σε οινογλεύκη, επιλέχθηκαν δύο non-Saccharomyces ζύμες, η Torulaspora delbrueckii (T.d.) και η Metschnikowia pulcherrima (M.p.) ως εναλλακτικές ζύμες έναντι των συμβατικών στελεχών του S. cerevisiae (S.c.). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο εμπορικά στελέχη T.d. 291 (Lallemand) και T.d. Prelude (Hansen) κι ένα εμπορικό στέλεχος M. pulcherrima (Flavia MP 346, Lallemand), σε σύγκριση με ένα στέλεχος S. cerevisiae (US-05, Fermentis by Lesaffre). Η έρευνα επικεντρώθηκε στη μελέτη της ικανότητας των συγκεκριμένων στελεχών να ζυμώσουν τα κύρια σακχάρα του βυνογλεύκους, στη μέτρηση της παραγόμενης αιθανόλης, στην κατανάλωση του ελεύθερου αζώτου αμινοξέων καθώς και στη διερεύνηση της επίδρασης της θερμοκρασίας ζύμωσης στην κινητική των ζυμώσεων. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκαν δύο διαφορετικές θερμοκρασίες ζύμωσης, 13 και 20 °C. Επίσης, με τη χρήση του αέριου χρωματογράφου μελετήθηκαν οι πτητικές ενώσεις που παρήχθησαν σε κάθε σάκχαρο ξεχωριστά. Με βάση τα άνωθεν, παρασκευάστηκαν συνθετικά υποστρώματα γλυκόζης, φρουκτόζης, μαλτόζης και ένα μίγμα των προαναφερθέντων σακχάρων σε αναλογίες που αντιστοιχούν με αυτές ενός τυπικού ζυθογλεύκους (86% μαλτόζη, 9% γλυκόζη και 5% φρουκτόζη) και ζυμώθηκαν στους 13 και 20 °C, με σκοπό τη μελέτη της κινητικής της ζύμωσης. Από τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης της ζύμωσης προέκυψε ότι όλα τα μελετώμενα στελέχη είναι ικανά να μεταβολίζουν όλα τα σάκχαρα, να παράγουν ικανοποιητική ποσότητα αιθανόλης και να αναπτύσσονται και στις δύο θερμοκρασίες, αλλά με βραδύτερο ρυθμό στους 13 °C. Η κατανάλωση της γλυκόζης ήταν ταχύτερη έναντι της φρουκτόζης, για την T. delbrueckii 291 στους 20 °C, ενώ για την T. delbrueckii Prelude στους 13 °C. Η μαλτόζη παρουσίασε χαμηλότερο ρυθμό κατανάλωσης συγκριτικά με τους μονοσακχαρίτες, και ειδικά στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, χωρίς να επιδρά στη συγκέντρωση των υπολειμματικών σακχάρων. Στη ζύμωση με T. delbrueckii 291 παρατηρείται φάση υστέρησης κατά τον μεταβολισμό της μαλτόζης αλλά και κατά την ανάπτυξή του, η οποία οφείλεται στη δυσκολία του συγκεκριμένου στελέχους να ενεργοποιήσει το ένζυμο μαλτάση. Στη ζύμωση με M. pulcherrima η κατανάλωση της μαλτόζης πραγματοποιείται βραδύτερα σε σχέση με τους δύο μονοσακχαρίτες (γλυκόζη και φρουκτόζη), παρουσιάζοντας χαμηλότερο ρυθμό μεταβολισμού καθώς και μικρή υστέρηση στην έναρξη της ζύμωσης.Το λογιστικό μοντέλο Monod χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη λόγω της απλότητας και της καλής του προσαρμογής. Το μοντέλο αυτό είναι σε θέση να προβλέψει τον ρυθμό ανάπτυξης βιομάζας για τη συμβατική ζύμη και το στέλεχος της T. delbrueckii Prelude, καθώς τα πειραματικά αποτελέσματα ανάπτυξης των κυττάρων παρουσίασαν καλή προσαρμογή, ωστόσο δεν εμφανίζει ικανοποιητική προσαρμογή για τα δεδομένα της T. delbrueckii 291, ειδικά στους 13 °C. Γενικότερα, η T. delbrueckii 291 παρουσίασε το μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης στους δύο μονοσακχαρίτες και ειδικότερα στη θερμοκρασία των 20 °C, ακολουθούμενη από το στέλεχος της M. pulcherrima Aντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης με τις τιμές k των non-Sacharromyces ζυμών να μη διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Η μέγιστη κυτταρική συγκέντρωση όλων των μη συμβατικών ζυμών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (p<0,05) από την αντίστοιχη του S.c US-05 σε όλα τα ζυμώσιμα σάκχαρα και θερμοκρασίες ζύμωσης. Η κυτταρική απόδοση βρέθηκε υψηλότερη στο στέλεχος της T. delbrueckii 291 στους δύο μονοσακχαρίτες. Ως προς τις ζύμώσεις των μικτών σακχάρων, η μέγιστη κυτταρική ανάπτυξη παρατηρείται στους 20 °C στις ζυμώσεις των Τ. delbrueckii 291 και M. pulcherrima, ενώ και στους 13 °C, οι non-Saccharomyces παρουσιάζουν υψηλότερο πληθυσμό από τον S. cerevisiae US-05. Η θερμοκρασία είχε σημαντική (p<0,05) επίδραση στην απόδοση της αιθανόλης. Οι άγριες ζύμες παρήγαγαν ποσότητες αιθανόλης ίσες ή και υψηλότερες από τον συμβατικό σακχαρομύκητα. Ειδικότερα, στους 13 °C, σημαντικά υψηλότερη ήταν η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης (40 g/L) από την Μ. pulcherrima (p<0,05) στη ζύμωση της μαλτόζης, ξεπερνώντας τις υπόλοιπες ζύμες. Αντίθετα, στους 20 °C, υψηλότερη συγκέντρωση παρήγαγε η συμβατική ζύμη (43 g/L). Επιπλέον, η τελική συγκέντρωση του ελεύθερου αζώτου των αμινοξέων διέφερε σημαντικά (p<0,05) μεταξύ των μελετώμενων στελεχών και των θερμοκρασιών ζύμωσης. Από τις άγριες ζύμες, εκείνη που παρουσίασε μεγαλύτερη ανάγκη σε άζωτο ήταν η Μ. pulcherrima σε όλα τα μελετώμενα σάκχαρα και στις δύο θερμοκρασίες ζύμωσης, ενώ μεταξύ των T. delbrueckii στελεχών μεγαλύτερη κατανάλωση παρουσίασε το στέλεχος 291. Οι πτητικές ενώσεις επηρεάστηκαν σημαντικά (p<0,05) από τη θερμοκρασία ζύμωσης και από το εξεταζόμενο σάκχαρο που χρησιμοποιήθηκε, ενώ όλα τα στελέχη παρήγαγαν ανώτερες αλκοόλες, λιπαρά οξέα μεσαίας αλυσίδας και τους εστέρες τους στη ζύμωση της μαλτόζης και των μικτών σακχάρων. Πιο συγκεκριμένα, τα δύο στελέχη T. delbrueckii παρουσίασαν υψηλές τιμές στην φαινυλαιθυλική αλκόολη, σε διαφορετικά σάκχαρα το κάθε ένα, με το 291 να παρουσιάζει τις υψηλότερες τιμές στη μαλτόζη, ενώ το Τ. delbrueckii Prelude στο μίγμα σακχάρων, στους 20 °C. Αντίστοιχα αποτελέσματα παρουσιάζονται στις ζυμώσεις της M. pulcherrima, με την τελευταία να παρουσιάζει τις μέγιστες τιμές στη φρουκτόζη και στο μίγμα. Στους 13 °C, τα εξεταζόμενα στελέχη παρουσίασαν υψηλότερες συγκεντρώσεις στους εστέρες των λιπαρών οξέων από τον S. cerevisiae US-05, και ταυτοχρόνως, ανιχνεύθηκαν περισσότεροι εστέρες σε σύγκριση με τους 20 °C. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης των πτητικών ενώσεων, το στέλεχος 291 παράγει τις μέγιστες συγκεντρώσεις στους 20 °C, ενώ το Τ. delbrueckii Prelude στους 13 °C. Ως προς τη ζύμωση με την M. pulcherrima, μεγαλύτερη παραγωγή των εστέρων των λιπαρών οξέων μεσαίας αλυσίδας παρατηρείται για τις ζυμώσεις στους 13 °C. Ως προς τα εξεταζόμενα σάκχαρα, οι περισσότεροι εστέρες ανιχνεύθηκαν στο μίγμα σακχάρων για τα δύο στελέχη T. delbrueckii, ενώ για την M. pulcherrima στη φρουκτόζη. Αφού διαπιστώθηκε η δυνατότητα ζύμωσης των κύριων σακχάρων, μελετήθηκε η παραγωγή ζύθου τύπου American Pale Ale, με αρχικές τιμές πυκνότητας 12,2±0,1 °P και pH 5,1±0,1. Στα πειράματα αυτά παρασκευάστηκαν διαφορετικές μπίρες οι οποίες ζυμώθηκαν με μονοκαλλιέργειες των μελετώμενων ζυμών S. cerevisiae US-05, T. delbrueckii 291, T. delbrueckii Prelude και M. pulcherrima, καθώς και με μικτές καλλιέργειες της συμβατικής ζύμης με κάθε στέλεχος Τ.d. σε αναλογία 1:10 και με M. pulcherrima σε αναλογίες 1:1 και 1:10 στους 13 και 20 °C. Ειδικότερα, για τη μικτή καλλιέργεια του S. cerevisiae US-05 με τα στελέχη της T. delbrueckii επιλέχθηκε η αναλογία 1:10, με βάση τη βιβλιογραφία, καθώς έχει βρεθεί ότι οι δύο μικροοργανισμοί στη συγκεκριμένη αναλογία αναπτύσσονται παράλληλα χωρίς ανταγωνισμό, παράγοντας ένα προϊόν με πολύ ενδιαφέρον αρωματικό προφίλ και υψηλά ποσοστά αιθανόλης. Όσον αφορά στο στέλεχος της M. pulcherrima δεν έχει δοκιμαστεί ξανά σε παραγωγή ζύθου, επομένως θεωρήθηκε χρήσιμο να εξεταστεί σε διαφορετικές αναλογίες, ούτως ώστε να μελετηθεί διεξοδικά η κινητική της ζύμωσης, ο ανταγωνισμός μεταξύ των δύο μικροοργανισμών καθώς και τα χαρακτηριστικά των παραγόμενων ζύθων. Αν και παρουσίασαν χαμηλότερους ρυθμούς ζύμωσης από τον S. cerevisiae US-05, οι μελετώμενες non-Saccharomyces ζύμες ήταν ικανές να παράγουν μπίρα τύπου American Pale Ale, τόσο σε μονοκαλλιέργειες όσο και σε ζυμώσεις μικτής καλλιέργειας και στις δύο εξεταζόμενες θερμοκρασίες (13 και 20 °C). Η μονοκαλλιέργεια T. delbrueckii 291 είχε το βραδύτερο μεταβολικό ρυθμό και στις δύο θερμοκρασίες, παρουσιάζοντας παρόμοια φάση υστέρησης με τις ζυμώσεις των συνθετικών υποστρωμάτων. Η κατανάλωση του FAN ήταν ταχύτατη στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης για όλες τις non-Saccharomyces ζύμες, προκειμένου να επιβιώσουν στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης καθώς και από το στρες της διάσπασης του δισακχαρίτη. Όσον αφορά στις ζυμώσεις με M. pulcherrima, στους 20 °C, η μεικτή ζύμωση με αναλoγία 1:1, παρουσίασε παρόμοιο μεταβολικό ρυθμό με τη συμβατική ζύμη, υποδεικνύοντας ότι στη μεικτή αυτή ζύμωση επικράτησε ο S. cerevisiae US-05. Oι μικτές ζυμώσεις των μη συμβατικών ζυμών παρουσίασαν περιεκτικότητα σε αιθανόλη στο τελικό προϊόν αντίστοιχη με αυτή του S. cerevisiae US-05, ειδικά στους 20 °C. Εξαίρεση αποτέλεσε η μεικτή ζύμωση του Τ.delbrueckii Prelude, του οποίου η παραγόμενη αιθανόλη (5,40±0,10% ABV) ξεπέρασε σημαντικά (p<0,05) τον S. cerevisiae US-05. Και στις δύο θερμοκρασίες οι μονοκαλλιέργειες παρήγαγαν χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Επιπλέον, στο τέλος της ζύμωσης, μετρήθηκε το χρώμα και η πικράδα των παραγόμενων ζύθων καθώς και μετά από διάστημα 30 ημερών προκειμένου να παρατηρηθεί η μεταβολή τους. Μετά από χρονικό διάστημα 30 ημερών παρατηρήθηκε ότι στις μικτές ζυμώσεις η κροκίδωση ήταν μεγαλύτερη από τις μονοκαλλιέργειες λόγω της παρουσίας του S. cerevisiae US-05. Μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών, οι μονοκαλλιέργειες των στελεχών της T. delbrueckii παρουσίασαν υψηλότερες τιμές χρώματος, σε σχέση με την M. pulcherrima, ενώ οι τιμές στην πικράδα δεν διαφοροποιήθηκαν σημαντικά στις περισσότερες ζυμώσεις. Όσον αφορά στη γεύση και το άρωμα των παραγόμενων ζύθων, η μεικτή ζύμωση του T. delbrueckii 291 παρουσίασε το πιο αρωματικό προφίλ στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, με περισσότερες φρουτώδεις νότες και ανθικά αρώματα, ενώ το στέλεχος T. delbrueckii Prelude στους 20 °C. Ως προς το στέλεχος Μ. pulcherrima, η μονοκαλλιέργεια είναι αυτή που διαφοροποιήθηκε σημαντικά (p<0,05) από τον S. cerevisiae US-05 και ειδικότερα στην υψηλή θερμοκρασία ζύμωσης, παρουσιάζοντας πλουσιότερο οργανοληπτικό προφιλ, καθώς μπορεί να ενισχύσει τη μπίρα με περισσότερες φρουτώδεις, αλλά και φαινολικές νότες, αφού στην περίπτωση του συγκεκριμένου στελέχους καταγράφηκε η υψηλότερη συγκέντρωση της 2-μεθοξυ-4-βινυλ-γουαιακόλης, η οποία είναι υπεύθυνη για πικάντικες νότες.Τέλος, οι παραπάνω ζύθοι, αφιλτράριστοι κι απαστερίωτοι, ωρίμασαν σε ψυκτικό θάλαμο στους 13 °C, για δύο χρόνια. Σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (1 μήνας, 6 μήνες, 1 και 2 χρόνια) συλλέχθηκαν δείγματα για τη μελέτη της εξέλιξης των αρωματικών ενώσεων κατά τη διάρκεια της παλαίωσης,. Γενικά, δεν ανιχνεύθηκαν off-flavors ενώσεις, όπως η χαρακτηριστική ένωση trans-2-nonenal (γεύση χαρτονιού), αλλά οι ζύθοι μεταβλήθηκαν αρωματικά. Οι πτητικές ενώσεις που παρήχθησαν στη ζύμωση των 13 °C, δεν αυξήθηκαν παρά μόνο κατά τη φάση της αυτόλυσης, χωρίς να ανιχνεύονται ενώσεις παλαίωσης. Αντίθετα, στις ζυμώσεις των 20 °C οι μεταβολές είναι σημαντικές (p<0,05), ιδίως για τη μονο- και τη μικτή ζύμωση του Τ. delbrueckii 291, επηρεάζοντας τη διαμόρφωση του οργανοληπτικού προφίλ των ζύθων. Στις ζυμώσεις της M. pulcherrima, οι σημαντικότερες μεταβολές καταγράφηκαν στη μονοκαλλιέργεια, ενώ και οι δύο εξεταζόμενες αναλογίες στις μικτές ζυμώσεις δεν διαφοροποιήθηκαν σημαντικά μεταξύ τους. Οι μεταβολές των πτητικών ενώσεων στον S. cerevisiae US-05 παρατηρήθηκαν στη ζύμωση των 20 °C, με σημαντική αύξηση των ανώτερων αλκοολών αλλά και των εστέρων των λιπαρών οξέων μεσαίας αλυσίδας κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, παρατηρήθηκε υδρόλυση των εστέρων σε όλες τις ζυμώσεις, γεγονός που μπορεί να είναι η κύρια αιτία για την απώλεια του φρουτώδη χαρακτήρα της μπίρας κατά την αποθήκευση και ωρίμανση. Γενικότερα στις non-Saccharomyces ζυμώσεις, τα φρουτώδη αρώματα, καθώς και τα αρώματα ανθέων μετατράπηκαν σε αρώματα πυρηνόκαρπων φρούτων, όπως του βερύκοκου και του ροδάκινου αλλά και καραμέλας, γεγονός που αποδίδεται στην αύξηση των αιθυλεστέρων και την ανίχνευση νέων πτητικών ενώσεων, όπως διαφόρων λακτονών που συνέβαλαν στο άρωμα και στη γεύση.Εν κατακλείδι, από τη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή βρέθηκε ότι οι μελετώμενες άγριες ζύμες είναι ικανές να παράγουν καινοτόμα προϊόντα μπίρας με ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, και επομένως αποτελούν μία βιώσιμη λύση για την διαφοροποίηση των μικροζυθοποιείων.