Μελέτη των υπεύθυνων γονιδίων για την αποτοξικοποίηση του L-(-) azetidine-2-carboxylic acid και του καταβολισμού του στον Aspergillus nidulans

Abstract

Plants produce toxic secondary metabolites as defense mechanisms against phytopathogenic microorganisms, competitive neighbor plants and predators. L-azetidine-2-carboxylic acid (AZC), a toxic proline analogue produced by members of the Liliaceae and Agavaciae families, is part of such a mechanism. AZC causes a broad range of toxic, inflammatory and degenerative abnormalities in human and animal cells, while some microorganisms have evolved specialized strategies for AZC resistance. However, the mechanisms underlying these processes are poorly understood. In this thesis dissertation, a widespread mechanism for AZC resistance in fungi is identified. Specifically, it is shown that the filamentous ascomycete Aspergillus nidulans is able to not only resist AZC toxicity but also utilize it as a nitrogen source. This assimilation, occurs through the γ-aminobutyric acid (GABA) catabolic pathway and the action of the AzhA hydrolase, a member of a large superfamily of detoxifying enzymes, the haloacid dehalogenaselike hydrolase (HAD) superfamily. The detoxification process of this proline toxic analogue, is further assisted by the NgnA acetyltransferase, an orthologue of Mpr1 belonging to Saccharomyces cerevisiae. Heterologous expression of AzhA suppresses AZC sensitivity of S. cerevisiae strains. Furthermore, a detailed phylogenetic analysis of AzhA homologues in Fungi, Archaea and Bacteria unravels a widespread mechanism for AZC resistance among several microorganisms, including important human and plant pathogens.

Τα φυτά παράγουν τοξικούς δευτερογενείς μεταβολίτες ως αμυντικούς μηχανισμούς έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών, ανταγωνιστικών γειτονικών φυτών και αρπακτικών. Το L‑αζετιδινο‑2‑καρβοξυλικό οξύ (L‑azetidine‑2‑carboxylic acid, AZC), είναι ένα τοξικό ανάλογο της προλίνης, το οποίο συντίθεται από μέλη των οικογενειών Liliaceae και Agavaciae και φέρεται να συμμετέχει σε έναν τέτοιο αμυντικό μηχανισμό των φυτών. Το AZC δύναται να προκαλέσει ένα ευρύ φάσμα τοξικών, φλεγμονωδών και εκφυλιστικών ανωμαλιών σε ανθρώπινα και ζωικά κύτταρα, ενώ είναι γνωστό ότι ορισμένοι μικροοργανισμοί έχουν αναπτύξει εξειδικευμένες στρατηγικές προκειμένου να παρουσιάζουν αντοχή έναντι του AZC. Ωστόσο, οι μηχανισμοί στους οποίους βασίζονται αυτές οι διεργασίες είναι ελάχιστα κατανοητοί. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός του μηχανισμού ανθεκτικότητας μυκήτων στο τοξικό ανάλογο της προλίνης AZC, ενός μηχανισμού ευρέως διαδεδομένου στους μύκητες.Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι ο νηματοειδής ασκομύκητας Aspergillus nidulans είναι ικανός όχι μόνο να αντισταθεί στην τοξικότητα του AZC αλλά και να το χρησιμοποιήσει ως πηγή αζώτου. Η αφομοίωση αυτή, πραγματοποιείται μέσω της μεταβολικής οδού του γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) και της δράσης της υδρολάσης AzhA, μέλους της haloacid dehalogenase‑like (HAD) υπεροικογένειας ενζύμων που συμμετέχουν σε αντιδράσεις αποτοξικοποίησης ποικίλων ουσιών. Η διαδικασία αποτοξικοποίησης του AZC υποβοηθείται περαιτέρω από την NgnA ακετυλοτρανσφεράση, ορθόλογου της Mpr1 ακετυλοτρανσφεράσης του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Ετερόλογη έκφραση της AzhA καταστέλει την ευαισθησία στο AZC στελεχών του S. cerevisiae. Λεπτομερής φυλογενετική ανάλυση των AzhA ομόλογων σε Μύκητες, Αρχαία και Βακτήρια, αποκαλύπτει έναν ευρέως διαδεδομένο μηχανισμό ανθεκτικότητας στο AZC στους μικροοργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων σημαντικών παθογόνων ανθρώπων και φυτών.