Μελέτη των αναπτυξιακών μηχανισμών που ενέχονται στην οργάνωση του χιτωνίου και του υποχιτωνίου του εμβρυϊκού εγκεφάλου του Felis catus

Abstract

The effort to understand the development and the evolution of the central nervous system (CNS) has led to the development of models which organize and compare experimental data. During the 20th century, advances in molecular biology enabled scientists to study the spatiotemporal expression of genes that regulate ontogenesis. Particularly in the CNS, gene expression analysis has led to the discovery of molecular boundaries and distinct progenitor domains that would be, otherwise, impossible to explore. The emerging field of neural genoarchitectonics, along with the study of the various progenitor domains among vertebrates belonging to distant taxa, redefined the concept of field homology and reevaluated the neuromeric models of CNS development, ultimately proposing the prosomeric model. According to this, the CNS is comprised of a series of segments, called neuromeres which are transverse metameric subunits, serially arranged along the anteroposterior axis of the neural tube. Neuromeres of the embryonic prosencephalon are named prosomeres and are classified into diencephalic (p1-p3) and secondary prosencephalic (hp1, hp2) prosomereres. The telencephalon is an alar plate derivative of both hp1 and hp2; the evaginated alar plate of hp1 gives rise to most of the pallium and the subpallium, while the non-evaginated telencephalic alar plate of hp2 produces the preoptic area. According to the prosomeric model and the derived developmental ontology, both the pallium and the subpallium are consisted of discreet domains that present unique gene expression patterns. Thus, the pallium is characterized by the unique expression of Tbr1/2, Pax6, Emx1/2, Lef1 & Ngn1/2, while the subpallium presents expression of Dlx1/2/5/6, Gsx1/2, Mash1, Nkx2-1 and Lhx6/7, among others. Moreover, the pallium is tetrapartite, comprising of four domains, namely the ventral, the lateral, the dorsal and the medial pallium, that represent anlagen of the olfactory bulb and cortex, claustrum, isocortex and hippocampal formation respectively. The subpallium also comprises of four genoarchitectonically distinct territories, that are the striatal, the pallidal, the diagonal and the preoptic division, that produce the caudoputamen complex, the globus pallidus, the diagonal band nuclei, and the preoptic nuclei respectively.In this study we applied the genoarchitectonic approach to study the embryonic brain of the domestic cat (Felis catus). Cats present a gyrencephalic brain, whose complexity places this species between the lissencephalic rodents and the complex gyrencephalic species (like primates). Moreover, the recent sequencing of its genome, in combination with the extended veterinary surveillance it enjoys, has revived both neuroscientific and translational medicine interest towards this species. The genoarchitectonic analysis was focused primarily on embryos between the E26 and the E27 day (E26/27) of development. In addition, we used embryos of earlier (E22/23; E24/25) or more advanced stages (E28/29; E34/35) to approximate the extent of developmental events. Marker genes were selected after systematic study of the data on mouse and on other vertebrates and gene segments were cloned into a suitable vector to generate the feline probes used in this study.In order to delineate the pallium and the subpallium, we comparatively studied Tbr2 and Dlx2 that are expressed in complementary domains, by the dividing cells residing in the respective proliferative zones. Furthermore, the ventral pallium was identified as an Emx1-negative and Tbr2- and Pax6- strongly positive domain, that further expressed low levels of Lhx2. The dorsal pallium was characterized as a pallial region strongly expressing Pax6, Lhx2 and Emx1, while in the medial pallium Lef1 transcripts were detected along with the previous. At E28/29, the lateral pallium was identified based on Nr4a2 expression. Regarding the subpallium, the striatal domain was mapped as a Dlx2/Mash1/Lhx2/Pax6-positive, Nkx2-1-negative domain. Transcripts of Nkx2-1 were detected in the pallidal, diagonal and preoptic domains; the two latter, in contrast with the pallidum, expressed also low levels of Lhx2. Finally, Er81 expression in the ventricular zone demarcated the border between the preoptic and the diagonal domain.While the spatial study indicated a high degree of conserved domains between the cat and the mouse embryonic telencephalon, temporal analysis suggested a complex pattern of heterochronies underlining the asynchronous nature of development. Key findings include:1.Dynamic expression of Tbr1 in the incipient cortical plate (cp) and Tbr2 in the ventricular zone of the various pallial domains suggested a sequential mode of neurogenesis, with the cp of the ventral pallium generated first and the cp of the medial pallium last.2.In the olfactory bulb, Tbr2-epxressing mitral cells can be identified in the intermediate zone as early as E22/23. At E24/25, Gad2 and Er81 expression between the ventricular and the intermediate zones indicate the settlement of the first subpallial interneurons.3.Expression of Nr4a2 in the lateral pallial mantle was detected in E28/29 and in later stages.4.Expression patterns of Emx1, Pax6 and Tbr2 in the amygdala changed from diffuse (E22/23) to focal (E24/25) indicating generation of the first nuclei.5.At E26/27, subpial expression of Tbr2 at the border of the medial pallium and the cortical hem marks the generation of the secondary matrix (or transient neurogenic zone) of the developing hippocampus.The results of this work suggest a complex pattern of heterochronies between the well-studied mouse and the cat, represented by shifts in the timing of developmental events, with several events occurring earlier in the cat and vice versa. For instance, feline E22/23 is generally equivalent to the murine E11.5 stage; olfactory bulb evagination, however, in the cat has already commenced at E22/23, while in mice this event takes place after E12. Notably, the murine lateral pallium expresses Nr4a2 as of E12.5 but this upregulation in the feline lateral pallium is detected after E28/29. Moreover, in the feline telencephalon developmental processes usually take much longer to complete and this feature may be very useful to accurately define distinct stages of a complex developmental process.In summary, the overall genoarchitecture of the feline telencephalon is conserved, with territories topologically equivalent to those previously described in other vertebrate species and especially in the mouse, according to the prosomeric model and the developmental ontology. In addition, they underline the heterochronous nature of developmental events in a comparative context between species. These results and the fact that the cat brain is gyrencephalic, suggest that this species can provide a useful animal model in the study of CNS ontogenesis and evolution. As this is the first systematic analysis of the feline telencephalic genoarchitecture, we hope that it will provide a basis for future research, especially given the re-appearance of the cat in neuroscience research.

Η προσέγγιση της ανάπτυξης του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) σε σχέση με την εξέλιξη των ειδών, οδήγησε τους νευροεπιστήμονες στην ανάπτυξη προτύπων όπου τα πειραματικά δεδομένα συστηματοποιούνται και αξιολογούνται. Η χρήση μεθόδων μοριακής βιολογίας για τη μελέτη της χωροχρονικής έκφρασης των γονιδίων, γνωστή και ως γονιδιοαρχιτεκτονική προσέγγιση, οδήγησε στη χαρτογράφηση μοριακά διακριτών επικρατειών με σαφή όρια, τα οποία δεν ήταν δυνατόν να ταυτοποιηθούν με άλλο τρόπο. Η γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη της ανάπτυξης του ΚΝΣ, σε διάφορα είδη σπονδυλωτών, επαναπροσδιόρισε αρκετές ομολογίες και οδήγησε στην αναθεώρηση των προτύπων για την ανάπτυξη του ΚΝΣ, οδηγώντας, τελικά, στην πρόταση του προσωμερικού προτύπου, το οποίο επιχειρεί να περιγράψει το αρχέτυπο οργάνωσης (Bauplan) του ΚΝΣ σε όλα τα σπονδυλωτά. Σε αντίθεση με παλαιότερα πρότυπα, το προσωμερικό πρότυπο προϋποθέτει ότι το ΚΝΣ των σπονδυλωτών αποτελείται από μία σειρά μεταμερικά οργανωμένων τμημάτων που ονομάζονται, γενικώς, νευρομερίδια και ειδικά στον πρόσθιο εγκέφαλο προσωμερίδια. Το προσωμερικό πρότυπο οδήγησε σε επαναξιολόγηση των συσχετίσεων μεταξύ των επιμέρους περιοχών του ΚΝΣ των θηλαστικών, γεγονός που οδήγησε στην ανάπτυξη μιας νέα οντολογίας για το ΚΝΣ. Σύμφωνα με το προσωμερικό πρότυπο, ο πρόσθιος εγκέφαλος διακρίνεται στον διεγκέφαλο, ο οποίος αποτελεί την καταβολή του προθαλάμου, του θαλάμου και της προτετραδυμικής περιοχής (προσωμερίδια p3, p2 και p1 αντίστοιχα), και στον δευτεροταγή πρόσθιο εγκέφαλο (προσωμερίδια hp1 και hp2), από τον οποίο προέρχονται ο υποθάλαμος και ο τελεγκέφαλος. Ενώ ο υποθάλαμος αποτελείται τόσο από το βασικό, όσο και από το πτερυγοειδές πέταλο, ο τελεγκέφαλος αποτελείται μόνο από το πτερυγοειδές. Αναλυτικότερα, από το εγκολπωμένο τμήμα του πτερυγοειδούς πετάλου του προσωμεριδίου hp1 προέρχονται το χιτώνιο και το μεγαλύτερο τμήμα του υποχιτωνίου. Αντίθετα, η προοπτική περιοχή αναπτύσσεται από το τελεγκεφαλικό τμήμα του πτερυγοειδούς πετάλου του προσωμεριδίου hp2, το οποίο δεν εγκολπώνεται.Το υποχιτώνιο διαφέρει από το χιτώνιο με βάση τη γονιδιακή έκφραση. Αναλυτικότερα, το χιτώνιο χαρακτηρίζεται από την έκφραση γονιδίων όπως τα Tbr1/2, Pax6, Emx1/2, Lef1 και Ngn1/2, ενώ το υποχιτώνιο από τα Dlx1/2/5/6, Gsx1/2, Mash1, Nkx2-1 και Lhx6/7, μεταξύ άλλων. Περαιτέρω, η γονιδιακή έκφραση επιτρέπει τη διαίρεση τόσο του υποχιτωνίου, όσο και του χιτωνίου σε διακριτές επικράτειες οι οποίες σχετίζονται με διαφορετικές μεταγεννητικές ανατομικές δομές και διακριτούς φαινοτύπους νευρώνων. Ειδικότερα, το χιτώνιο διακρίνεται σε κοιλιακό, πλάγιο, ραχιαίο και μέσο τομέα, οι οποίοι συσχετίζονται με τις καταβολές του οσφρητικού εγκεφάλου (οσφρητικός βολβός και οσφρητικός αλλοφλοιός), του προτειχίσματος, του ισοφλοιού και του ιπποκάμπειου σχηματισμού αντίστοιχα. Το υποχιτώνιο διακρίνεται με βάση τη γονιδιακή έκφραση σε τέσσερεις επικράτειες, οι οποίες ονομάζονται ραβδωτή, ωχρή, διαγώνια και προοπτική επικράτεια και αποτελούν τις καταβολές του συμπλέγματος κερκοφόρου πυρήνα/καλύπτρας, της ωχρής σφαίρας, της διαγώνιας ταινίας και των προοπτικών πυρήνων αντίστοιχα.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να προσεγγίσει και να ερμηνεύσει την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου στην κατοικίδια γάτα (Felis catus), χρησιμοποιώντας την γονιδιοαρχιτεκτονική μεθοδολογία, σύμφωνα με το προσωμερικό πρότυπο και την απορρέουσα αναπτυξιακή οντολογία. Το συγκεκριμένο ζωικό είδος παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τις νευροεπιστήμες, δεδομένων των μορφολογικών χαρακτηριστικών αλλά και της πολυπλοκότητας του εγκεφάλου του, που το τοποθετούν ενδιάμεσα των λειεγκέφαλων και των γυρεγκέφαλων θηλαστικών. Επιπλέον, η γάτα αποτέλεσε δημοφιλές ζωικό πρότυπο κατά τη διάρκεια του 20ου αιώνα, ενώ μετά την αλληλούχιση του γονιδιώματός της και δεδομένης της εκτεταμένης κτηνιατρικής επιτήρησης που απολαμβάνει, επανακάμπτει τόσο στις νευροεπιστήμες όσο και στη μεταφραστική έρευνα. Για την γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη του εμβρυικού τελεγκεφάλου στη γάτα χρησιμοποιήθηκαν γονίδια-δείκτες των επιμέρους περιοχών τόσο του χιτωνίου όσο και του υποχιτωνίου, τα οποία επιλέχθηκαν μετά από συστηματική μελέτη αντίστοιχων εργασιών στον ποντικό και σε άλλα σπονδυλόζωα. Ακολούθως, τμήματα των γονιδίων-δεικτών κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα ώστε να χρησιμοποιηθούν ως ιχνηθέτες σε έμβρυα γάτας. Ο κύριος όγκος της ανάλυσης πραγματοποιήθηκε σε έμβρυα μεταξύ της 26ης και 27ης ημέρας (Ε26/27), ενώ χρησιμοποιήθηκαν έμβρυα πρωιμότερων (Ε22/23 και Ε24/25) ή πιο ανεπτυγμένων (Ε28/29 και Ε34/35) σταδίων για τη χρονολόγηση των επιμέρους διαδικασιών.Αναλυτικότερα, η έκταση του χιτωνίου και του υποχιτωνίου, καθώς και το μεταξύ τους όριο, προσδιορίστηκαν με βάση τις επικράτειες έκφρασης των γονιδίων Tbr2 και Dlx2 αντίστοιχα, τα οποία εμφανίζουν στις πολλαπλασιαστικές ζώνες των ανωτέρω συμπληρωματικά πρότυπα. Η θέση και η έκταση του κοιλιακού χιτωνίου μελετήθηκε με τη βοήθεια πρωτίστως της απουσίας έκφρασης Emx1, η οποία αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου τομέα, και δευτερευόντως με βάση την ισχυρή έκφραση των Pax6 και Tbr2, αλλά και την ισχνή έκφραση του Lhx2. Αντίστοιχα, το ραχιαίο χιτώνιο χαρακτηρίστηκε από έκφραση των γονιδίων Pax6, Lhx2 και Emx1, ενώ στο μέσο χιτώνιο εκτός από τα ανωτέρω ανιχνεύθηκαν μετάγραφα του Lef1. Ακόμη, το πλάγιο χιτώνιο προσδιορίστηκε με τη βοήθεια του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Nr4a2. Με τον ίδιο τρόπο, η ραβδωτή επικράτεια του υποχιτωνίου χαρακτηρίστηκε από έκφραση των γονιδίων Dlx2, Mash1, αλλά απουσία του Nkx2-1, το πρότυπο έκφρασης του οποίου περιορίστηκε στην ωχρή, τη διαγώνια και την προοπτική επικράτεια. Η διαγώνια και η προοπτική επικράτεια διαφοροποιήθηκαν, σε σχέση με την ωχρή, μέσω της ισχνής έκφρασης Lhx2 στις πρώτες, ενώ, ακολούθως, το όριο της διαγώνιας επικράτειας με την προοπτική υποδείχθηκε με βάση την έκφραση του Er81.Η παραπάνω ανάλυση υπέδειξε ότι τα πρότυπα έκφρασης των ανωτέρω γονιδίων και κατά συνέπεια τα κύρια διαμερίσματα του χιτωνίου και του υποχιτωνίου, είναι συντηρημένα μεταξύ της γάτας και του ποντικού. Επιπλέον, η μελέτη της δυναμικής της γονιδιακής έκφρασης, σε έμβρυα διαφορετικών σταδίων, χρησιμοποιήθηκε για τη χρονολόγηση της ανάπτυξης διαφορετικών δομών στον τελεγκέφαλο, ενώ τα κυριότερα ευρήματα είναι τα εξής:1.Η δυναμική έκφραση του Tbr1 στη φλοιική πλάκα και η εξίσου δυναμική έκφραση του Tbr2 στην κοιλιακή ζώνη, των διαφόρων τομέων του χιτωνίου, αποκαλύπτουν ότι η νευρογένεση σε αυτό ακολουθεί συγκεκριμένο χωροχρονικό πρότυπο: προηγείται η ανάπτυξη της φλοιικής πλάκας του κοιλιακού χιτωνίου, ενώ η αντίστοιχη στο μέσο χιτώνιο αναπτύσσεται τελευταία.2.Στον οσφρητικό βολβό, τα πρώτα Tbr2-θετικά μιτροειδή κύτταρα εντοπίζονται στη διάμεση ζώνη ήδη κατά το στάδιο Ε22/23, ενώ οι πρώτοι Gad2/Er81-θετικοί διάμεσοι νευρώνες εντοπίζονται μεταξύ της κοιλιακής και της διάμεσης ζώνης στο στάδιο Ε24/25.3.Η εστιακή έκφραση του γονιδίου Nr4a2 στην καταβολή του προτειχίσματος εντοπίστηκε από το στάδιο Ε28/29 κι έπειτα.4.Η αμυγδαλή παρουσίασε εστιακή έκφραση των Emx1, Pax6 και Tbr2 από το στάδιο Ε24/25 και μετά, παραπέμποντας στην εμφάνιση των πρώτων πυρηνόμορφων δομών.5.Η παρουσία Tbr2-θετικών κυττάρων Cajal-Retzius στη μηνιγγική επιφάνεια του μέσου χιτωνίου, στο όριο με το φλοιικό χείλος εμβρύων σταδίου Ε26/27, σηματοδότησε την έναρξη του σχηματισμού της δευτεροταγούς μήτρας του ιπποκάμπου.Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ένα περίπλοκο πρότυπο ετεροχρονισμών μεταξύ του ποντικού και της γάτας, όπως φαίνεται από διαφορές στο χρονισμό των αναπτυξιακών γεγονότων: ορισμένα συμβαίνουν νωρίτερα στη γάτα σε σχέση με στον ποντικό και αντιστρόφως. Για παράδειγμα, το στάδιο E22/23 στη γάτα ισοδυναμεί σε γενικές γραμμές με το στάδιο E11,5 του ποντικού: η εγκόλπωση ωστόσο του οσφρητικού βολβού, στη γάτα έχει ήδη ξεκινήσει από την E22/23, ενώ στον ποντικό αυτό λαμβάνει χώρα μετά την E12. Αντίστοιχα, η έκφραση Nr4a2 στο πλάγιο χιτώνιο του ποντικού ανιχνεύεται ήδη από την Ε12,5, ενώ στη γάτα από την Ε28/29 κι έπειτα. Επιπλέον, φαίνεται ότι στη γάτα απαιτείται, εν γένει, μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για την ολοκλήρωση των αναπτυξιακών διεργασιών· αυτό το χαρακτηριστικό δύναται να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη της ανάπτυξης και συγκεκριμένα στον ακριβή προσδιορισμό των διακριτών σταδίων μιας πολύπλοκης διαδικασίας, όπως η οντογένεση του τελεγκεφάλου.Συνοψίζοντας, η παρούσα, γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη έδειξε ότι ο τελεγκέφαλος της γάτας διαιρείται σε περιοχές τοπολογικά ισοδύναμες με εκείνες που έχουν περιγραφεί σε άλλα είδη σπονδυλωτών, και ειδικά στον ποντικό, σε συμφωνία με το προσωμερικό πρότυπο και την απορρέουσα οντολογία. Επιπλέον, αναδεικνύεται η ετερόχρονη φύση των αναπτυξιακών γεγονότων, όταν αυτά μελετώνται υπό το εξελικτικό πρίσμα μεταξύ διαφορετικών ειδών, έστω και αν η μεταξύ τους (εξελικτική) απόσταση είναι μικρή. Τα παραπάνω αποτελέσματα, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η γάτα ανήκει στα γυρεγκέφαλα θηλαστικά, αναδεικνύουν το συγκεκριμένο είδος υπογραμμίζοντας τη σημασία του ως ζωικού προτύπου στη μελέτη της οντογένεσης και της εξέλιξης του ΚΝΣ. Καθώς αυτή είναι η πρώτη συστηματική ανάλυση της γονιδιοαρχιτεκτονικής του τελεγκεφάλου της γάτας, προσδοκούμε ότι θα αποτελέσει έρεισμα, δεδομένης της επανεμφάνισης του εν λόγω είδους στη νευροεπιστημονική έρευνα.