Εγκλεισμός του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 και εφαρμογή του σε τρόφιμο

Abstract

The encapsulation of probiotic bacteria is defined as the process of entrapping probiotic cells in food-grade materials in order to produce particles with a thin, semipermeable film having a diameter of a few nanometers to a few millimeters. The produced beads can be incorporated into food matrices for the production of probiotic products. The aim of the encapsulation technology is the limitation of probiotic cell deterioration or loss when exposed to adverse conditions during storage and/or consumption. In addition, the encapsulation of probiotic bacteria provides the food industry with flexibility in developing products containing certain bacterial species. In the current thesis, the encapsulation of probiotic bacteria is examined in order to subsequently integrate the encapsulated probiotic cells into a food matrix. The probiotic strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 was selected for the encapsulation, whereas the extrusion and the emulsification techniques were applied as the encapsulation methods. The extrusion method is based on the addition of the encapsulation blend, containing the probiotic cells, to a CaCl2 solution, leading to the formation of beads through crosslinking. Accordingly, the emulsification method is based on the dispersion of an aqueous phase containing the encapsulating blend and the probiotic bacteria within an oil phase and the forthcoming emulsion formation. When the emulsion comes in contact with a CaCl2 solution, crosslinking occurs as in the case of extrusion, resulting in the conversion of the droplets into solid particles. The encapsulation blends applied through these two encapsulation methods, included: sodium alginate on its own, as well as in combination with other materials either conventional such as xanthan, glycerol, κ-carrageenan and whey powder along with pectin, or innovative materials, such as nanocrystalline cellulose (CNC). Moreover, the use of milk instead of water for the preparation of the sodium alginate solution was studied. Inulin, glucose or L-cysteine-HCl were also added into the encapsulation blends in order to examine their effect on the viability of the probiotic bacteria. Moreover, an innovative encapsulation method was applied which combines a double w1/o/w2 emulsion with the extrusion technique, aiming to the increase of the provided protection. The application of this innovative method included the use of various encapsulating agents (alginate only, alginate-pectin, alginate-gelatin, alginate-casein, alginate-arabic gum) as the external phase for the formation of the double emulsion. Based on the ζ-potential and viscosity values, the most stable emulsion was selected for extrusion. In each case, the probiotic strain BB-12 was incorporated into the internal phase of the double emulsion along with inulin. Furthermore, the option of coating the produced beads with chitosan was studied. The aim of the above was to evaluate the ability of these materials to encapsulate probiotic bacteria and protect them efficiently during refrigerated or frozen storage, as well as during their exposure to simulated gastrointestinal conditions. The efficacy of each method regarding the encapsulation of the probiotic strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 was examined through the encapsulation yield (EY%), whereas the provided protection was assessed by determining the survival rates (SR%) of the probiotic cells. All of the above were determined through microbiological analysis. Scanning Electron Microscopy (SEM) was also used in order to study the structure and morphology of the encapsulation products. The first two encapsulation methods (extrusion, emulsification) resulted in high encapsulation yield values, with the best results, generally, being achieved through the emulsification technique (84.2-99.7%) versus the extrusion technique (58.6-100%). Regarding the examined encapsulation agents, the milk-alginate-glucose blend provided the best results, with encapsulation yields of 100.0% and 99.2% through the extrusion and emulsification technique, respectively. High encapsulation efficiency values were also achieved through the combination of alginate with other materials, such as carrageenan and CNC, reaching up to 91.3% through the extrusion method and up to 98.8% through the emulsification method. These encapsulation blends form a sufficiently stable and dense grid which successfully encloses a great percentage of probiotic cells. Thus, they are proposed as effective carriers of probiotic bacteria. In contrast, the use of sodium alginate alone as an encapsulating agent resulted in lower encapsulation yields (60.5% through extrusion and 86.9% through emulsification), whereas the addition of xanthan, glycerol or a mixture of whey powder and pectin significantly increased these values, either in the case of extrusion (73.2, 78.0, 86.9% respectively), or in the case of emulsification (87.1, 92.6 and 87.4%). Furthermore, the addition of glucose was proved to be favorable for the viability of probiotic cells during encapsulation, slightly increasing the encapsulation yield.The encapsulation blends (blends of alginate with glucose and κ-carrageenan, CNC or milk) which resulted in high encapsulation yield values provided, also, adequate protection to the encapsulated probiotic cells both during refrigerated or frozen storage and exposure to simulated gastrointestinal conditions. The highest survival rates during storage at 4oC were achieved through the extrusion technique, exceeding 72%, in contrast with the survival rates achieved using the same encapsulation blends through emulsification (> 51.1%). The use of alginate alone as an encapsulation agent did not provide satisfactory results and, thus, its combination with other materials was examined. As in the case of the encapsulation yield, the optimal results were achieved through the combination of milk with alginate, providing survival rates up to 72.0% in the case of encapsulation through extrusion and 52.7% in the case of encapsulation through emulsification, after 30 days of storage at 4oC. In the case of the extrusion method, the combination of alginate with xanthan, glycerol, whey-pectin powder mixture, carrageenan or CNC maintained the probiotic cells’ survival rates up to 28.6-37.8% until the end of 30-days storage. Also, it is worth noting that the addition of glucose in all the encapsulating blends, except from the milk-alginate blend, led to significant viability increase (12.9-42.2%) during refrigerated storage. The addition of inulin to each encapsulation blend increased, in most cases, the viability of the probiotic cells. A similar trend regarding the behavior of the encapsulating blends was observed during storage at -18οC; the utilization of the previously referred encapsulating blends (blends of alginate with glucose and κ-carrageenan, CNC or milk) led to survival rates of 69.9-82.4% when encapsulation was applied through extrusion and 49.6-55.2% when it was applied through emulsification. Regarding the bacterial load of the beads produced through extrusion, it was maintained at levels above 6 log cfu g-1 for up to 30 days of storage at 4oC or -18oC in the case of blends of carrageenan, CNC or milk with alginate and glucose. In addition, in the case of storage at low temperatures, the addition of glycerol in the encapsulation blend significantly contributed to the viability maintenance; after 30 days of storage at -18οC, survival rates of 82.5% and 57.1% were achieved in the case of extrusion and emulsification technique, respectively.The results obtained from the exposure of encapsulated probiotic bacteria to simulated gastrointestinal conditions were also encouraging; the best survival rates were achieved in the case of beads produced through the extrusion of the milk-alginate blend (78.4%). The respective beads produced through emulsification maintained the viability of the probiotic strain BB-12 up to 45.7%. In addition, as alginate alone did not provide adequate protection to the encapsulated probiotic cells, its combinations with carrageenan, xanthan, whey powder-pectin or CNC were tested. This resulted in increased survival rates of 7.9-44.6% in the case of extrusion and of 28.1% in the case of emulsification. The addition of the prebiotic inulin to the encapsulating blend had a significant effect on the viability of probiotic cells when exposed to simulated gastrointestinal conditions, as it increased their survival at all cases. On the other hand, the addition of glucose or L-cysteine-HCl to the encapsulation blend did not contribute significantly to the viability of the encapsulated probiotic bacteria.According to the beads’ examination by scanning electron microscopy (SEM), the addition of glucose, carrageenan, CNC or milk to the encapsulation blend improved the structure of the extrusion products, as no cracks or discrete pores were observed, thus confirming the protective effect on the probiotic bacteria. The beads produced through emulsification were characterized by smaller size, more uneven morphology and tendency to form agglomerates.Regarding the encapsulation of BB-12 through the innovative method that combines the double w1/o/w2 emulsion with the extrusion technique, the aquatic solution of alginate on its own, was the most stable, based on the ζ-potential and the viscosity values of the solutions used as the external phase of the double emulsions. The alginate solution had the highest absolute ζ-potential value (-65.1 mV), whereas the aquatic solution of gum arabic and alginate had the lowest absolute ζ-potential value (-18.8 mV). The double emulsion formed with alginate only as the external phase had the highest absolute ζ-potential value (3.4 mV) and the lowest viscosity value (34.3 cP) in comparison to the other double emulsions that exhibited absolute ζ-potential values between 0.1-1.6 mV and viscosity values between 56.7 and 283.4 cP. The application of this double emulsion with or without inulin for the encapsulation of BB-12, as well as with or without chitosan coating, led to encapsulation yields ranging between 72.5% and 81.6%. The incorporation of the probiotic strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 into the internal phase of the double w1/o/w2 resulted, in all cases, in maintaining the viability above 6 log cfu g-1 during storage at 4oC or -18oC. Coating the beads with chitosan resulted in optimal survival rates (82-86.1%) after the exposure of the beads to simulated gastrointestinal conditions. Based on the overall results, the best encapsulation products obtained through the most sustainable methods were incorporated in milk along with conventional starter culture for the production of probiotic yogurt. Thus, in the last part of the thesis, the beads produced through extrusion and emulsification - which are considered industrially applicable methods – encapsulated with blends of alginate with glucose and carrageenan, CNC, milk or a mixture of whey powder and pectin were used. The fermentation process was accelerated by the addition of both encapsulated or free probiotic bacteria. The encapsulation of probiotic bacteria reduced their contribution to fermentation; the fermentation of products with beads produced through emulsification exhibited the shortest latent phases (176-186 min) and fermentation times (205-210 min) and the higher absolute values of maximum pH reduction rate (0.032-0.036 min-1), regardless of the encapsulating agent used. The addition of encapsulated probiotic bacteria increased both the viscosity values of yogurt (up to 45483 cP versus 18594 cP of yogurt with only conventional culture after 24 h of storage at 4oC) and the values of firmness (up to 0.82 N versus 0.62 N in the case of yogurt with only conventional culture), adhesiveness (up to 0.65 N·s versus 0.31 N·s in the case of yogurt with only conventional culture) and elasticity (3.01 to 2.15 in the case of yogurt with only conventional culture). In agreement with the results reported earlier, the encapsulation of probiotic bacteria, especially through the extrusion technique, increased their survival rates both during storage and exposure to simulated gastrointestinal conditions. The maximum survival rates were achieved when the probiotic cells were encapsulated into an alginate-milk blend through the extrusion method, reaching up to 81.6%, after 30 days of refrigerated storage (compared with 35% in the case of conventional yogurt) and 85.3% upon exposure to simulated gastrointestinal conditions.

Ο εγκλεισμός των προβιοτικών κυττάρων ορίζεται ως η διεργασία κατά την οποία προβιοτικά κύτταρα εγκλείονται μέσα σε υλικά κατάλληλα για τρόφιμα, προκειμένου να παραχθούν σωματίδια με λεπτή, ημιπερατή μεμβράνη, διαμέτρου από μερικά nm έως μερικά mm. Τα παραγόμενα σφαιρίδια (προϊόντα εγκλεισμού) μπορούν να ενσωματωθούν σε προϊόντα τροφίμων για την παραγωγή προβιοτικών προϊόντων. Ο σκοπός της τεχνολογίας του εγκλεισμού είναι ο περιορισμός της φθοράς ή απώλειας των προβιοτικών κυττάρων κατά την έκθεσή τους σε αντίξοες συνθήκες κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης ή/και της κατανάλωσης. Ακόμη, ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων παρέχει στη βιομηχανία τροφίμων ευελιξία κατά την παραγωγή προϊόντων που περιέχουν τα συγκεκριμένα είδη βακτηρίων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο εγκλεισμός προβιοτικών βακτηρίων με σκοπό την επακόλουθη ενσωμάτωση των προϊόντων εγκλεισμού σε προϊόν τροφίμου. Το προβιοτικό στέλεχος που επιλέχθηκε προς εγκλεισμό ήταν το στέλεχος Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, ενώ οι μέθοδοι εγκλεισμού που εφαρμόστηκαν ήταν η τεχνική της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης, καθώς επίσης και μία καινοτόμος μέθοδος η οποία συνδυάζει διπλό νερό-σε-λάδι-σε-νερό γαλάκτωμα με την τεχνική της εξώθησης, με στόχο την αύξηση της παρεχόμενης προστασίας στα προβιοτικά κύτταρα. Η τεχνική της εξώθησης στηρίζεται στην στάγδην προσθήκη του διαλύματος του εγκλειστικού μέσου που εμπεριέχει τα προς εγκλεισμό προβιοτικά κύτταρα σε διάλυμα CaCl2 με σκοπό την παραγωγή σφαιριδίων μέσω δημιουργίας σταυροειδών δεσμών μεταξύ του εγκλειστικού μέσου και των ιόντων Ca2+. Αντίστοιχα, η τεχνική της γαλακτωματοποίησης στηρίζεται στη διασπορά μίας υδατικής φάσης που εμπεριέχει το εγκλειστικό μέσο και τα προβιοτικά βακτήρια εντός μίας λιπαρής φάσης και τον σχηματισμό γαλακτώματος. Όταν το γαλάκτωμα έρχεται σε επαφή με διάλυμα CaCl2, πραγματοποιείται σχηματισμός σταυροειδών δεσμών όπως και στην περίπτωση της εξώθησης, με αποτέλεσμα τα σταγονίδια εντός της λιπαρής φάσης να μετατρέπονται σε στερεά σωματίδια. Τα εγκλειστικά μίγματα που εξετάστηκαν κατά την εφαρμογή των δύο πρώτων μεθόδων εγκλεισμού (εξώθηση και γαλακτωματοποίηση) περιελάμβαναν τα εξής: αλγινικό νάτριο μόνο του ως εγκλειστικό μέσο, καθώς και σε μίγμα με άλλα υλικά είτε συμβατικά, όπως ξανθάνη, γλυκερόλη, κ-καραγενάνη και σκόνη ορού γάλακτος μαζί με πηκτίνη, είτε καινοτόμα όπως νανοκρυσταλλική κυτταρίνη (CNC). Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η χρήση γάλακτος αντί νερού για την παρασκευή του διαλύματος του εγκλειστικού μέσου αλγινικού νατρίου. Ακόμη, σε κάθε εγκλειστικό μίγμα εξετάστηκε η προσθήκη ινουλίνης, γλυκόζης ή L-κυστεΐνης-HCl, προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή επίδραση αυτών στη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων. Κατά την εφαρμογή της καινοτόμου μεθόδου που συνδυάζει διπλό ν1/ε/ν2 γαλάκτωμα με την τεχνική της εξώθησης έγινε μελέτη διαφόρων εγκλειστικών μέσων (αλγινικό, αλγινικό-πηκτίνη, αλγινικό-ζελατίνη, αλγινικό-καζεΐνη, αλγινικό-αραβικό κόμμι) για το σχηματισμό του διπλού γαλακτώματος και επιλέχθηκε προς εφαρμογή το σταθερότερο γαλάκτωμα με βάση τις τιμές του ζ-δυναμικού και του ιξώδους του διπλού ν1/ε/ν2 γαλακτώματος. Σε κάθε περίπτωση, στην εσωτερική φάση του διπλού γαλακτώματος έγινε ενσωμάτωση του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 μαζί με ινουλίνη. Ακόμη, μετά το πέρας του εγκλεισμού εξετάστηκε και η πιθανότητα επικάλυψης των προκυπτόντων σφαιριδίων με χιτοζάνη. Στόχος όλων των ανωτέρω ήταν η αξιολόγηση της ικανότητας των συγκεκριμένων μέσων να ενθυλακώσουν τα προβιοτικά βακτήρια και να τους παρέχουν επαρκή προστασία τόσο κατά τη διατήρηση των προκυπτόντων προϊόντων εγκλεισμού υπό ψύξη ή κατάψυξη, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος. Η αποτελεσματικότητα κάθε μεθόδου ως προς τον εγκλεισμό του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 εξετάστηκε μέσω της απόδοσης εγκλεισμού (ΕΥ%), ενώ η παρεχόμενη προστασία αξιολογήθηκε μέσω εκτίμησης του ποσοστού επιβίωσης (SR%) των προβιοτικών κυττάρων. Όλα τα παραπάνω προσδιορίστηκαν μέσω μικροβιολογικών αναλύσεων. Έγινε, επίσης, χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) με σκοπό τη μελέτη της δομής και της μορφολογίας των προϊόντων εγκλεισμού. Από τα πειράματα προέκυψε ότι και οι δύο πρώτες μέθοδοι εγκλεισμού (εξώθηση, γαλακτωματοποίηση) παρείχαν υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού, με τα καλύτερα αποτελέσματα να επιτυγχάνονται εν γένει μέσω της τεχνικής της γαλακτωματοποίησης (84.2-99.7%) έναντι της τεχνικής της εξώθησης (58.6-100%). Από τα εγκλειστικά μέσα που μελετήθηκαν, καλύτερο αποδείχθηκε το μίγμα γάλακτος-αλγινικού-γλυκόζης, με αποδόσεις εγκλεισμού 100.0% και 99.2% μέσω των τεχνικών της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης, αντίστοιχα. Σημαντικά υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού επιτεύχθηκαν και μέσω συνδυασμού του αλγινικού με άλλα υλικά, την κ-καραγενάνη και το CNC, φτάνοντας μέχρι και 91.3% μέσω εξώθησης και 98.8% μέσω γαλακτωματοποίησης. Τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μίγματα δημιουργούν ένα αρκετά σταθερό και πυκνό πλέγμα, εγκλείοντας με επιτυχία μεγάλο ποσοστό προβιοτικών κυττάρων, και ως εκ τούτου προτείνονται ως αποτελεσματικοί φορείς εγκλεισμού των προβιοτικών βακτηρίων. Αντίθετα, η χρήση μόνο αλγινικού νατρίου ως εγκλειστικού μέσου οδήγησε στις χαμηλότερες αποδόσεις εγκλεισμού (60.5% μέσω εξώθησης και 86.9% μέσω γαλακτωματοποίησης), ενώ η προσθήκη ξανθάνης, γλυκερόλης ή μίγματος σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης αύξησε αρκετά τις τιμές αυτές, είτε στην περίπτωση της εξώθησης (73.2, 78.0, 86.9% αντίστοιχα), είτε στην περίπτωση της γαλακτωματοποίησης (87.1, 92.6 και 87.4%). Ακόμη, η προσθήκη γλυκόζης φάνηκε να ευνοεί τη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων κατά τη διάρκεια του εγκλεισμού, αυξάνοντας ελαφρώς την απόδοση εγκλεισμού. Τα ίδια εγκλειστικά μίγματα (μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC ή γάλα) που έδωσαν υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού παρείχαν, επίσης, ικανοποιητική προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά κύτταρα τόσο κατά τη διατήρηση των προϊόντων εγκλεισμού υπό ψύξη ή κατάψυξη, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης. Τα υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης κατά την αποθήκευση των προϊόντων εγκλεισμού στους 4οC επιτεύχθηκαν μέσω της τεχνικής της εξώθησης, ξεπερνώντας το 72%, σε αντίθεση με τα ποσοστά επιβίωσης που επιτεύχθηκαν με τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μίγματα μέσω γαλακτωματοποίησης (>51.1%). Η χρήση, μόνο, αλγινικού ως εγκλειστικό μέσο δεν είχε ικανοποιητικά αποτελέσματα, και έτσι μελετήθηκε ο συνδυασμός του με άλλα υλικά. Τα βέλτιστα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν, όπως και στην περίπτωση της απόδοσης εγκλεισμού, μέσω συνδυασμού γάλακτος με αλγινικό, με ποσοστά επιβίωσης, μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης στους 4οC, που ανέρχονταν στο 72.0% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω εξώθησης και στο 52.7% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης. Στην περίπτωση του εγκλεισμού μέσω εξώθησης, ο συνδυασμός αλγινικού με ξανθάνη, γλυκερόλη, μίγμα σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης, κ-καραγενάνη ή CNC βοήθησε στη διατήρηση ενός μέρους της βιωσιμότητας των προβιοτικών κυττάρων (28.6-37.8%) μέχρι το τέλος των 30 ημερών αποθήκευσης στους 4οC. Ακόμη, αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλα τα εγκλειστικά μίγματα πέραν του μίγματος γάλακτος-αλγινικού, η προσθήκη γλυκόζης οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση (12.9-42.2%) της βιωσιμότητας κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης υπό ψύξη. Η προσθήκη, επίσης, ινουλίνης σε κάθε εγκλειστικό μίγμα αύξησε μερικώς στις περισσότερες περιπτώσεις τη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων. Αντίστοιχη τάση, όσον αφορά τη συμπεριφορά των εγκλειστικών μιγμάτων, παρατηρήθηκε και κατά την αποθήκευση των προϊόντων εγκλεισμού στους -18οC, καθώς με τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μέσα (μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC ή γάλα) επιτεύχθηκαν ποσοστά επιβίωσης 69.9-82.4% μέσω εξώθησης και 49.6-55.2% μέσω γαλακτωματοποίησης. Όσον αφορά το βακτηριακό φορτίο των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης, αυτό διατηρήθηκε σε επίπεδα άνω των 6 log cfu g-1 μέχρι και για 30 ημέρες αποθήκευση στους 4οC ή στους -18οC στην περίπτωση των μιγμάτων κ-καραγενάνης, CNC ή γάλακτος με αλγινικό και γλυκόζη. Επιπρόσθετα, στην περίπτωση αποθήκευσης σε τόσο χαμηλές θερμοκρασίες η προσθήκη γλυκερόλης στο εγκλειστικό μίγμα είχε σημαντική συμβολή, με αποτέλεσμα τα ποσοστά επιβίωσης του προβιοτικού στελέχους μετά από διατήρηση στους -18οC για 30 ημέρες να φτάνουν στο 82.5% στην περίπτωση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης και στο 57.1% στην περίπτωση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης.Εξίσου ενθαρρυντικά ήταν τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη δοκιμή προσομοίωσης πέψης, με τα βέλτιστα ποσοστά επιβίωσης του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 (78.4%) να επιτυγχάνονται στα προϊόντα εγκλεισμού που παρήχθησαν μέσω εξώθησης με εγκλειστικό μέσο το μίγμα γάλακτος-αλγινικού. Τα αντίστοιχα προϊόντα εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης διατήρησαν τη βιωσιμότητα του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 μέχρι και 45.7%. Επιπρόσθετα, καθώς το αλγινικό μόνο του δεν παρείχε επαρκή προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά κύτταρα, δοκιμάστηκαν συνδυασμοί αλγινικού με κ-καραγενάνη, ξανθάνη, σκόνη ορού γάλακτος-πηκτίνη ή CNC, οι οποίοι αύξησαν τα ποσοστά επιβίωσης κατά 7.9-44.6% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω εξώθησης και μέχρι 28.1% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης. Η προσθήκη της πρεβιοτικής ουσίας, της ινουλίνης, είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων κατά την έκθεσή τους σε σύστημα προσομοίωσης πέψης, αυξάνοντας σε κάθε περίπτωση τα ποσοστά επιβίωσης, ενώ η προσθήκη γλυκόζης ή L-κυστεΐνης-HCl δεν είχε κάποια σημαντική συνεισφορά στη βιωσιμότητα των εγκλεισμένων προβιοτικών βακτηρίων μέσω των δύο μεθόδων εγκλεισμού.Από την παρατήρηση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) προέκυψε ότι η προσθήκη γλυκόζης, κ-καραγενάνης, CNC ή γάλακτος στο εγκλειστικό μίγμα βελτίωσε τη δομή των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης, στα οποία επιβεβαιώθηκε η απουσία ρωγμών ή διακριτών πόρων, επαληθεύοντας την παρεχόμενη προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά βακτήρια. Τα προϊόντα εγκλεισμού που παρήχθησαν μέσω γαλακτωματοποίησης χαρακτηρίζονταν από μικρότερο μέγεθος, περισσότερο ανομοιόμορφη μορφολογία και είχαν τάση σχηματισμού συσσωματωμάτων. Κατά την εφαρμογή της καινοτόμου μεθόδου εγκλεισμού μέσω συνδυασμού διπλού ν1/ε/ν2 γαλακτώματος με την τεχνική της εξώθησης, με βάση τις μετρήσεις του ζ-δυναμικού και του ιξώδους των διαλυμάτων που εξετάστηκαν για χρήση ως εξωτερική φάση του διπλού γαλακτώματος, προέκυψε ως καταλληλότερο μέσο εγκλεισμού το αλγινικό καθώς οδήγησε στο σχηματισμό του πιο σταθερού γαλακτώματος. Συγκεκριμένα, το διάλυμα αλγινικού εμφάνισε την υψηλότερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (-65.1 mV). Αντίθετα, το διάλυμα μίγματος αραβικού κόμμεος και αλγινικού οξέος είχε τη χαμηλότερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (-18.8 mV). Το διπλό γαλάκτωμα που σχηματίστηκε με εξωτερική φάση μόνο αλγινικό εμφάνισε τη μεγαλύτερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (3.4 mV) και τη χαμηλότερη τιμή ιξώδους (34.3 cP) σε σύγκριση με τα υπόλοιπα εξεταζόμενα ν1/ε/ν2 γαλακτώματα που εμφάνισαν απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού μεταξύ 0.1-1.6 mV και τιμές ιξώδους μεταξύ 56.7-283.4 cP. Η εφαρμογή του μέσου αυτού ως εγκλειστικού με τους συνδυασμούς που αναφέρθηκαν παραπάνω οδήγησε σε τιμές απόδοσης εγκλεισμού που κυμάνθηκαν μεταξύ 72.5% και 81.6%. Η ενσωμάτωση του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 εντός της εσωτερικής φάσης του διπλού ν1/ε/ν2 ¬¬είχε ως αποτέλεσμα τη διατήρηση της βιωσιμότητάς του πάνω από το ελάχιστο όριο των 6 log cfu g-1 σε κάθε περίπτωση κατά τη διάρκεια αποθήκευσης στους 4οC ή στους -18οC. Η επικάλυψη των προϊόντων εγκλεισμού με χιτοζάνη οδήγησε στα βέλτιστα ποσοστά επιβίωσης (82-86.1%) κατά την έκθεση των προϊόντων εγκλεισμού σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης.Με βάση τα συνολικά αποτελέσματα έγινε επιλογή των κατάλληλων προϊόντων εγκλεισμού, τα οποία παρήχθησαν μέσω των πιο βιώσιμων βιομηχανικά μεθόδων εγκλεισμού, για ενσωμάτωσή τους σε γάλα μαζί με συμβατική καλλιέργεια εκκίνησης με σκοπό την παραγωγή προβιοτικού γιαουρτιού. Έτσι, στο τελευταίο μέρος της διδακτορικής διατριβής τα προϊόντα που παρήχθησαν μέσω των τεχνικών της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης (τεχνικές που θεωρούνται άμεσα εφαρμόσιμες σε βιομηχανική κλίμακα) με βάση τα εγκλειστικά μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC, γάλα, ή συνδυασμό σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης ενσωματώθηκαν σε γάλα για παραγωγή προβιοτικού γιαουρτιού. Έγινε μελέτη της επίδρασης εγκλεισμένων ή ελεύθερων προβιοτικών βακτηρίων στη διεργασία της ζύμωσης κατά την προσθήκη τους στο γάλα σε συνδυασμό με συμβατική καλλιέργεια εκκίνησης. Η χρήση τόσο εγκλεισμένων όσο και ελεύθερων προβιοτικών βακτηρίων επηρέασε την εξέλιξη της ζύμωσης του γάλακτος (λανθάνουσα φάση, φάση μέγιστου ρυθμού μείωσης pH, συνολικός χρόνος ζύμωσης) επιταχύνοντας τη συνολική διεργασία παραγωγής του γιαουρτιού. Ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων περιόρισε τη συνεισφορά τους στη ζύμωση, ενώ μικρότερη λανθάνουσα φάση (176-186 min) και συνολικό χρόνο ζύμωσης (205-210 min) και μεγαλύτερη απόλυτη τιμή μέγιστου ρυθμού μείωσης pH (0.032-0.036 min-1) εμφάνισαν τα γιαούρτια με προϊόντα εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης, ανεξάρτητα από το χρησιμοποιούμενο εγκλειστικό μέσο. Η χρήση εγκλεισμένων προβιοτικών βακτηρίων αύξησε τόσο τις τιμές του ιξώδους του γιαουρτιού (έως και 45483 cP έναντι 18594 cP γιαουρτιού μόνο με συμβατική καλλιέργεια μετά από 24 h αποθήκευση στους 4οC) όσο και τις τιμές της σταθερότητας του πήγματος (έως 0.82 Ν έναντι 0.62 Ν στην περίπτωση γιαουρτιού μόνο με συμβατική καλλιέργεια), της προσκολλησιμότητας (έως 0.65 N·s έναντι 0.31 N·s στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια) και της ελαστικότητας (3.01 έως έναντι 2.15 στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια). Ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων, ειδικά μέσω της τεχνικής της εξώθησης, αύξησε το ποσοστό επιβίωσής τους τόσο κατά την αποθήκευση των γιαουρτιών, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος. Τα μέγιστα ποσοστά επιβίωσης επιτεύχθηκαν κατά τον εγκλεισμό των προβιοτικών κυττάρων σε μίγμα αλγινικού-γάλακτος μέσω εξώθησης, πλησιάζοντας το 81.6% μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης του γιαουρτιού υπό ψύξη (έναντι 35.0% στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια) και το 85.3% κατά την έκθεση σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος.